Perché le piastre Petri in plastica possono influire negativamente sull’imaging a fluorescenza
Se le immagini a fluorescenza mostrano un segnale di fondo inaspettato, un segnale più debole del previsto o una qualità complessivamente scarsa, il problema potrebbe essere la piastra di coltura cellulare. Ecco le basi scientifiche del motivo per cui le piastre di coltura in plastica possono compromettere la qualità delle immagini e come verificare se la causa del problema è il substrato.
Il problema spesso attribuito ad altre cause dai ricercatori
Nella microscopia a fluorescenza, il segnale di fondo e la distorsione ottica non sono solo problemi di qualità dell’immagine, ma anche dei dati. In molti casi, la causa è la stessa piastra di coltura. Un segnale di fondo elevato, una fluorescenza debole e misurazioni che variano da un esperimento all’altro sono problemi frustranti nella microscopia a fluorescenza e vengono spesso attribuiti erroneamente alla preparazione del campione o alle impostazioni dello strumento. La piastra è raramente la prima variabile presa in considerazione dai ricercatori.
Le piastre di plastica per colture cellulari, in particolare quelle in polistirene, introducono due problemi ottici distinti che compromettono direttamente la qualità delle immagini a fluorescenza. Capire quali sono e come individuarli è il primo passo per eliminarli.
Due problemi distinti, un unico substrato
È importante distinguere i due meccanismi, perché influiscono sui dati in modo diverso e richiedono soluzioni diverse:
La distorsione ottica è un problema fisico. La plastica diffonde e devia la luce a causa di irregolarità nello spessore del materiale e nell’indice di rifrazione, riducendo nitidezza e contrasto prima ancora che il segnale raggiunga il rilevatore. Se esposto a lunghezze d’onda di eccitazione, il polistirene emette luce propria, aggiungendo un segnale di fondo che compete direttamente con la fluorescenza del campione.
L’autofluorescenza è un fenomeno riconducibile a diversi fluorofori endogeni. Vi contribuiscono numerosi fattori, tra cui i coenzimi del metabolismo cellulare, le proteine della matrice extracellulare (ECM), i fissativi chimici e la qualità del substrato.
Il risultato di questi fattori è che le immagini sono allo stesso tempo sfocate e disturbate dal rumore, oltre ad apparire eccessivamente saturate, rendendo difficile un’interpretazione accurata anche per i ricercatori più esperti.
Distorsione ottica: come la plastica interferisce con il percorso della luce
La microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione dipende dal fatto che la luce percorra un tragitto preciso e prevedibile dalla sorgente luminosa, attraverso il substrato e il campione, fino all’obiettivo. Il polistirene altera questo percorso in due modi.
In primo luogo, il polistirene ha un indice di rifrazione più elevato e meno uniforme rispetto al vetro di grado ottico. Attraversando il fondo della piastra, la luce viene deviata e diffusa in modo imprevedibile dalle disomogeneità del materiale. In pratica, la nitidezza dell'immagine diminuisce. I dettagli strutturali più fini appaiono meno definiti o più grandi di quanto siano realmente, mentre il contrasto tra strutture adiacenti si riduce.
In secondo luogo, le piastre in polistirene vengono prodotte con uno spessore variabile sul fondo. Gli obiettivi ad alta apertura numerica, come quelli a immersione in olio 60x e 100x usati per acquisire immagini cellulari dettagliate, sono corretti otticamente per uno spessore preciso del substrato, circa 170 µm, corrispondente a quello di un vetrino coprioggetto standard. Quando lo spessore del substrato varia o si discosta da questo valore, aumenta l'aberrazione sferica e la risoluzione diminuisce, spesso in modo significativo proprio agli ingrandimenti in cui è più importante.
Per le acquisizioni di routine a basso ingrandimento, questi effetti possono essere tollerabili. Nelle acquisizioni strutturali ad alta risoluzione, nelle analisi di colocalizzazione o in qualsiasi esperimento in cui la precisione spaziale è importante, introducono errori difficili da correggere in post-produzione.
Autofluorescenza: quando è la piastra stessa a brillare
Il polistirene è un materiale intrinsecamente fluorescente. Se esposto alla luce di eccitazione, emette un ampio segnale di fondo che si sovrappone a molti dei coloranti e delle proteine fluorescenti comunemente usati nella ricerca in biologia cellulare.
L'effetto è più marcato nella gamma di eccitazione blu-verde, corrispondente alle lunghezze d'onda usate per eccitare DAPI, Hoechst, GFP e FITC. Di conseguenza, ogni volta che la sorgente luminosa è accesa, il fondo della piastra interferisce con il tuo marcatore fluorescente.
Le conseguenze sono più gravi quando:
- L'intensità del segnale è bassa, come nel caso di costrutti con proteine fluorescenti a bassa espressione o proteine marcate endogenamente
- Per rilevare il segnale sono necessari tempi di esposizione lunghi
- Si effettuano misurazioni quantitative dell'intensità della fluorescenza
- Nello stesso esperimento si acquisiscono immagini in più canali di fluorescenza
In questi casi, l'autofluorescenza del polistirene non si limita ad aggiungere rumore. Può mascherare completamente il segnale, alterare le misurazioni quantitative e generare una fluorescenza apparente nei canali in cui non è presente alcun marcatore.
Perché la plastica emette fluorescenza
Il polistirene emette fluorescenza per via della sua struttura molecolare. Le catene polimeriche che lo compongono contengono anelli aromatici, strutture cicliche di carbonio che assorbono facilmente la luce di eccitazione e la riemettono sotto forma di fluorescenza a banda larga. È una proprietà intrinseca del materiale, non un difetto di produzione né un problema di contaminazione. Non si può eliminare lavando, bloccare con i comuni reagenti di blocco o correggere modificando le impostazioni di acquisizione. Il segnale di fondo è intrinseco alla piastra.
L’autofluorescenza delle piastre di plastica non è nemmeno costante. L’esposizione ai raggi UV, i cicli di sterilizzazione ripetuti e la conservazione prolungata o inadeguata possono aumentarne i livelli nel tempo, man mano che la struttura del polimero si degrada. Per questo motivo, il segnale di fondo può variare tra lotti di piastre di plastica, tra piastre conservate in condizioni diverse o tra i primi e gli ultimi utilizzi di piastre dello stesso lotto, introducendo una variabile difficile da tenere in considerazione negli esperimenti quantitativi.
Il vetro si comporta in modo sostanzialmente diverso. Il vetro borosilicato, usato nelle applicazioni ottiche di precisione, compresi i vetrini coprioggetto per microscopi, non contiene le strutture polimeriche aromatiche responsabili della fluorescenza del polistirene. La sua autofluorescenza nello spettro visibile è trascurabile: ecco perché è il substrato preferito nella strumentazione ottica fin da molto prima dell’avvento dell’imaging di cellule vive. In microscopia a fluorescenza, questo significa che al rivelatore arriva solo il segnale che l’esperimento è progettato per generare.
Quali esperimenti sono più a rischio
Anche se le piastre di plastica influiscono in una certa misura su tutte le tecniche di imaging a fluorescenza, alcuni flussi di lavoro ne risentono in modo sproporzionato:
Reporter fluorescenti a bassa espressione — le proteine marcate endogenamente, i reporter knock-in e i costrutti espressi da promotori deboli producono segnali tali che l’autofluorescenza di fondo può interferire più facilmente.
Pannelli di immunofluorescenza multiplex — l’uso di più canali aumenta l’impatto complessivo dell’autofluorescenza e rende più difficile la separazione spettrale.
Misurazioni quantitative dell’intensità di fluorescenza — qualsiasi saggio in cui l’intensità assoluta o relativa del segnale costituisce il parametro di misurazione è direttamente compromesso da un segnale di fondo variabile proveniente dal substrato.
Imaging di cellule vive in time-lapse — le sessioni di acquisizione prolungate accumulano rumore di fondo nel tempo e richiedono una stabilità termica che la plastica non garantisce in modo affidabile quanto il vetro.
Microscopia a super-risoluzione — tecniche come STORM, PALM e STED operano ai limiti della risoluzione ottica e sono molto sensibili a qualsiasi fonte di fondo o aberrazione.
Come capire se il problema è la piastra
Se rilevi un segnale di fondo inspiegabile o risultati di fluorescenza incoerenti, questa lista di controllo può aiutarti a capire se la causa è il substrato:
- Acquisisci un’immagine di una piastra vuota, senza cellule né marcatori, usando le normali condizioni di eccitazione. Un segnale visibile conferma l’autofluorescenza del substrato.
- Confronta i risultati con diverse lunghezze d’onda di eccitazione. L’autofluorescenza del polistirene è più intensa nella gamma blu-verde. Se il fondo è più elevato nei canali DAPI o GFP rispetto ai canali rossi, la plastica è probabilmente una delle cause.
- Passa a un piatto con fondo in vetro mantenendo condizioni identiche. Una significativa riduzione del segnale di fondo conferma che il problema era il substrato.
- Verifica la variabilità tra i piatti. Se i livelli di fondo differiscono tra piatti dello stesso lotto, le incongruenze di spessore e indice di rifrazione della plastica contribuiscono alla distorsione.
- Prova un sistema di microscopio diverso. Se il problema dipende dal piatto e non dallo strumento, il substrato è una variabile da considerare.
Come il vetro elimina entrambi i problemi
Il vetro di qualità ottica risolve entrambi i problemi alla radice. Il suo indice di rifrazione uniforme e lo spessore controllato con precisione eliminano la diffusione della luce e l'aberrazione sferica introdotte dalla plastica. La sua autofluorescenza trascurabile nello spettro visibile elimina completamente il segnale di fondo, lasciando solo la fluorescenza che il tuo esperimento è progettato per rilevare.
I piatti con fondo in vetro dello spessore dei coprioggetti (~170 µm) sono pienamente compatibili con obiettivi a immersione in olio ad alta apertura numerica, sistemi confocali, TIRF e piattaforme di super-risoluzione, strumenti per i quali i limiti della plastica sono più rilevanti.
→ Per una panoramica del confronto tra vetro e plastica rispetto a tutte le principali proprietà di imaging, consulta Piatti per colture cellulari in vetro o plastica: quali sono migliori per l'imaging?
FluoroDish™ di WPI: progettato per eliminare le variabili del substrato
I piatti per colture cellulari FluoroDish™ di WPI affrontano direttamente entrambe le cause del degrado delle immagini. Il fondo in vetro di qualità ottica è realizzato con lo spessore standard dei coprioggetti (~170 µm), garantendo la compatibilità con obiettivi ad alta apertura numerica ed eliminando le variazioni di spessore che causano aberrazione sferica nei piatti di plastica. La superficie in vetro non fluorescente produce un segnale di fondo trascurabile nello spettro visibile.
FluoroDish™ utilizza inoltre un adesivo biocompatibile e privo di citotossine per fissare il fondo in vetro, un aspetto importante per i ricercatori che lavorano con embrioni, cellule primarie o modelli derivati da iPSC, per i quali la lisciviazione dell'adesivo potrebbe compromettere la vitalità cellulare o i risultati sperimentali.
Disponibile in diverse dimensioni e compatibile con rivestimenti superficiali come collagene, poli-D-lisina e fibronectina, FluoroDish™ supporta un'ampia gamma di tipi cellulari e flussi di lavoro sperimentali in ambito accademico, CRO e farmaceutico.
→ Per informazioni su come scegliere la configurazione del piatto più adatta alla tua applicazione specifica, consulta Come scegliere il piatto per colture cellulari più adatto alla microscopia.
Domande frequenti
Perché la mia immagine a fluorescenza presenta un segnale di fondo elevato?
Il fondo elevato nell'imaging a fluorescenza può avere diverse cause, ma spesso la piastra per colture cellulari viene trascurata. Le piastre in polistirene emettono autofluorescenza se esposte alla luce di eccitazione, aggiungendo un segnale aspecifico indistinguibile dalla fluorescenza effettiva del campione. Acquisire immagini di una piastra di plastica vuota nelle condizioni standard di eccitazione permette di verificare se il substrato contribuisce al segnale. Passare a una piastra con fondo in vetro è il modo più diretto per eliminare il fondo dovuto al substrato.
Le piastre di plastica possono causare risultati falsi positivi di fluorescenza?
Sì. L'autofluorescenza del polistirene può generare un segnale in canali in cui non è presente alcun marcatore fluorescente, in particolare nella gamma di eccitazione blu-verde usata per DAPI, GFP e FITC. Negli esperimenti multiplex, questo può apparire come marcatura aspecifica o colocalizzazione inattesa. Verificare i risultati su piastre con fondo in vetro è un metodo affidabile per stabilire se il segnale apparente è reale o deriva dal substrato.
Quali canali di fluorescenza sono maggiormente influenzati dall'autofluorescenza della plastica?
L'autofluorescenza del polistirene è più intensa nella gamma blu-verde, quindi i canali DAPI, Hoechst, GFP e FITC sono i più vulnerabili. I canali nel rosso lontano sono generalmente meno influenzati; per questo, quando lavorano con piastre di plastica, a volte i ricercatori passano ai fluorofori nel rosso lontano. Passare al vetro è una soluzione più completa, che elimina il problema in tutti i canali.
Come faccio a capire se la mia piastra per colture cellulari causa artefatti di imaging?
Il test più affidabile consiste nell'acquisire immagini di una piastra vuota usando le impostazioni standard di acquisizione. Qualsiasi segnale visibile conferma la presenza di autofluorescenza del substrato. Puoi anche confrontare immagini acquisite su piastre di plastica e piastre con fondo in vetro in condizioni identiche. Una riduzione significativa del fondo sul vetro conferma che il substrato è la fonte dell'artefatto.
Qual è la piastra migliore per l'imaging di proteine fluorescenti a bassa espressione?
Le piastre con fondo in vetro sono vivamente consigliate per qualsiasi esperimento che utilizzi costrutti fluorescenti a bassa espressione. Quando i livelli del segnale sono intrinsecamente bassi, l'autofluorescenza dei substrati in plastica danneggia in misura proporzionalmente maggiore il rapporto segnale-rumore. Le piastre con fondo in vetro dello spessore di un coprioggetto, come FluoroDish™, offrono l'ambiente a basso fondo e ad alta risoluzione necessario per questi esperimenti.
La distorsione della plastica influisce allo stesso modo su tutti gli obiettivi del microscopio?
No. Gli obiettivi a ingrandimento e apertura numerica ridotti sono meno sensibili alle variazioni di spessore del substrato e alle incongruenze dell'indice di rifrazione. Il problema diventa più rilevante con gli obiettivi a immersione in olio ad alta apertura numerica (60x, 100x), corretti otticamente per vetri coprioggetto di spessore preciso. L'uso di questi obiettivi con piastre di plastica aumenta l'aberrazione sferica e riduce la risoluzione proprio agli ingrandimenti in cui i dettagli strutturali sono più importanti.
