Perché lo spessore del vetrino coprioggetto è importante in microscopia

Osserva un qualsiasi obiettivo per microscopio Plan Achromat e vedrai «0.17» stampato sul barilotto. Si riferisce allo spessore del coprioggetto in millimetri, ovvero alle specifiche del substrato attraverso cui l'obiettivo è stato progettato per acquisire immagini. Se queste specifiche non vengono rispettate, la qualità dell'immagine ne risente. Ecco cosa significa quel numero, perché esiste e cosa succede se lo si ignora.

Il numero sul barilotto dell'obiettivo

Gli obiettivi per microscopio Plan Achromat sono progettati in base a una serie di parametri ottici precisi, tra cui l'ingrandimento laterale, il mezzo di immersione (se necessario), l'apertura numerica, lo spessore del coprioggetto (standardizzato dal settore a 0.17mm/170 µm) e, talvolta, la distanza di lavoro.

Lo spessore standard di 0.17mm per i coprioggetti deriva dalle proprietà fisiche del vetro borosilicato e dai requisiti pratici dell'imaging biologico. Con questo spessore, il vetro è abbastanza sottile da consentire distanze di lavoro ridotte e angoli di raccolta della luce ampi, ma anche abbastanza resistente da poter essere maneggiato senza rompersi. Da oltre un secolo i produttori di obiettivi progettano i propri prodotti in base a questo valore, e la correzione integrata nei moderni obiettivi apocromatici lo presuppone con precisione.

Uno spessore diverso da quello standard introduce errori ottici che l'obiettivo non è in grado di correggere da solo.

Come vengono corretti gli obiettivi per lo spessore del coprioggetto

Per capire perché lo spessore è importante, è utile comprendere cosa significa concretamente la correzione dell'obiettivo a livello di progettazione delle lenti.

La luce che attraversa un campione biologico passa attraverso il substrato e, talvolta, il mezzo (cioè l'olio), che si tratti del coprioggetto o del fondo di una capsula, prima di entrare nell'obiettivo. Attraversando l'interfaccia vetro-mezzo di immersione, viene rifratta. L'angolo e l'entità della rifrazione dipendono sia dallo spessore del substrato sia dal suo indice di rifrazione. In genere, il progetto dell'obiettivo tiene conto di questa rifrazione introducendo elementi ottici compensatori all'interno del barilotto stesso. Questi elementi sono calcolati specificamente per 0.17mm di vetro borosilicato con un indice di rifrazione di circa 1.515.

Questa correzione è più complessa e cruciale negli obiettivi apocromatici (APO), che sono corretti cromaticamente per quattro lunghezze d'onda e sfericamente per più colori simultaneamente. Più correzioni incorpora un obiettivo, più dipende dal rispetto preciso delle specifiche del substrato. Un obiettivo plan-apocromatico a immersione in olio 100⨉ rappresenta il culmine di questa filosofia progettuale. È straordinariamente performante entro i parametri per cui è stato progettato e molto sensibile alle variazioni nella configurazione.

→ Per una spiegazione dettagliata dei tipi di obiettivo, della correzione delle aberrazioni e dell’apertura numerica, consulta Capire gli obiettivi del microscopio.

Cosa succede quando lo spessore si discosta da 0,17mm

Quando la luce attraversa un substrato più spesso, più sottile o meno uniforme rispetto alle specifiche di progettazione dell’obiettivo, la correzione compensativa interna all’obiettivo non corrisponde più alla rifrazione effettiva che avviene all’interfaccia con il vetro. Il risultato è un’aberrazione sferica, una condizione in cui i raggi luminosi che entrano nell’obiettivo con angolazioni diverse vanno a fuoco in punti leggermente diversi lungo l’asse ottico, anziché convergere su un unico piano focale. In pratica, l’aberrazione sferica dovuta a uno spessore del substrato non corretto produce:

Perdita di risoluzione assiale – Le strutture a diverse profondità nel campione sembrano andare a fuoco in punti diversi, rendendo inaffidabili l’imaging a stack di piani z e la ricostruzione tridimensionale.

Riduzione della risoluzione laterale – I dettagli strutturali fini che dovrebbero essere distinguibili si confondono, riducendo il potere risolutivo effettivo dell’obiettivo al di sotto del limite teorico.

Perdita di intensità – La luce che dovrebbe contribuire all’immagine a fuoco si ridistribuisce in aloni fuori fuoco, riducendo l’intensità del segnale e aumentando quella del fondo.

Spostamento del fuoco – Il piano focale apparente si sposta rispetto alla posizione effettiva del campione, compromettendo l’accuratezza del posizionamento lungo l’asse z nell’imaging quantitativo e negli esperimenti su cellule vive.

Questi effetti aumentano con l’NA. Un obiettivo a secco 10⨉ con un’NA di 0,25 tollera relativamente bene le variazioni del substrato. Un obiettivo a immersione in olio 100⨉ con un’NA di 1,4, invece, no. Con un’NA elevata, anche una variazione di 10–20 µm nello spessore del substrato causa un degrado misurabile dell’immagine. Ecco perché le specifiche del substrato sono più importanti proprio quando le prestazioni di imaging contano maggiormente, cioè agli ingrandimenti e alle risoluzioni usati per l’imaging dettagliato di cellule e strutture subcellulari.

→ Per le definizioni di apertura numerica, risoluzione e distanza di lavoro, consulta Nozioni di base sul microscopio.

Mezzi di immersione e adattamento dell’indice di rifrazione

Lo spessore del substrato non è l’unico fattore. Interagisce direttamente con il mezzo di immersione, il materiale che riempie lo spazio tra la lente frontale dell’obiettivo e la superficie del substrato.

Gli obiettivi a immersione in olio sono progettati per uno specifico olio da immersione con un indice di rifrazione di 1.515, che corrisponde quasi a quello del vetro borosilicato. Questa corrispondenza riduce al minimo la rifrazione all’interfaccia tra obiettivo e substrato e permette alla correzione interna dell’obiettivo di funzionare come previsto. Quando l’indice di rifrazione, lo spessore o entrambi del substrato differiscono da quelli del vetro borosilicato, la corrispondenza degli indici di rifrazione viene meno e l’aberrazione sferica aumenta di conseguenza.

Gli obiettivi a immersione in acqua sono progettati per un indice di rifrazione di 1.33 e tollerano intrinsecamente meglio le variazioni del substrato; sono quindi più adatti per campioni spessi o per l’acquisizione di immagini attraverso mezzi ad alto contenuto d’acqua. Gli obiettivi a secco, che operano in aria con un indice di rifrazione di 1.00, sono i più tolleranti alle variazioni del substrato, ma hanno un’apertura numerica (NA) limitata e, di conseguenza, una risoluzione inferiore.

Per ottenere immagini a fluorescenza alla massima risoluzione, spesso con tecniche confocali, TIRF o di super-risoluzione, si utilizzano normalmente obiettivi a immersione in olio. Sono anche quelli più sensibili alle specifiche del substrato. Usarli con un substrato diverso dal vetro borosilicato da 0.17mm compromette l’adattamento dell’indice di rifrazione su cui si basa la progettazione dell’obiettivo, aggravando l’aberrazione sferica causata dalla variazione di spessore.

Collari di correzione: un rimedio, non una soluzione

Alcuni obiettivi includono un collare di correzione, ovvero un anello regolabile sul corpo dell’obiettivo che sposta gli elementi interni delle lenti per compensare le variazioni di spessore del substrato. I collari di correzione sono utili, ma è importante conoscerne i limiti.

In genere, i collari di correzione coprono un intervallo di spessori del substrato (comunemente da 0.14mm a 0.20mm), che varia però a seconda dell’obiettivo. Entro questo intervallo, possono ridurre in modo significativo l’aberrazione sferica causata dalle variazioni di spessore. Sono particolarmente utili quando si acquisiscono immagini attraverso mezzi di profondità variabile o si utilizzano substrati non standard.

Tuttavia, i collari di correzione presentano importanti limiti pratici:

• Per impostarli correttamente, è necessario regolarli manualmente e osservare direttamente la qualità dell’immagine. Questo processo può richiedere molto tempo e introdurre variazioni tra gli operatori, soprattutto nei flussi di lavoro di imaging automatizzati o ad alta produttività.
• Compensano solo le variazioni di spessore. Non correggono la discrepanza tra l’indice di rifrazione del materiale del substrato e le specifiche di progetto dell’obiettivo. Una piastra in plastica con lo spessore corretto ma l’indice di rifrazione sbagliato produrrà comunque immagini aberrate, anche se il collare di correzione è regolato correttamente.
• Non sono disponibili su tutti gli obiettivi. Molti obiettivi apocromatici a immersione in olio ad alta NA, inclusi quelli usati per TIRF e la super-risoluzione, hanno una correzione fissa e sono progettati per vetro borosilicato da 0,17 mm, senza possibilità di adattamento alle deviazioni.

L’approccio più affidabile consiste nell’eliminare del tutto la variabile del substrato usando una piastra conforme alle specifiche, invece di cercare di compensare un substrato non conforme.

→ Per indicazioni sulla regolazione della messa a fuoco e sull’impostazione del microscopio, consulta Come regolare un microscopio.

Perché le piastre in plastica non rispettano questa specifica

Le piastre standard in plastica per colture cellulari non rispettano la specifica sullo spessore del coprioggetto per due motivi simultanei.

• Le piastre in polistirene sono prodotte con una base il cui spessore varia in genere da 1 mm a 2 mm, ben oltre la specifica di 0,17 mm e l’intervallo di compensazione di qualsiasi collare di correzione. La luce che attraversa il fondo di una piastra in plastica incontra una quantità di materiale molte volte superiore a quella per cui è corretto un obiettivo ad alta NA, introducendo una grave aberrazione sferica che non può essere eliminata con regolazioni.
• Il polistirene ha un indice di rifrazione di circa 1,59, significativamente diverso da quello di 1,515 del vetro borosilicato. Anche se fosse possibile produrre una piastra in plastica con uno spessore di 0,17 mm, la discrepanza nell’indice di rifrazione comprometterebbe comunque la correzione ottica integrata nell’obiettivo.

Queste due deviazioni si sommano. Di conseguenza, le piastre in plastica sono fondamentalmente incompatibili con il progetto ottico degli obiettivi ad alta NA, non per una questione di grado, ma di specifiche. Nessuna regolazione può compensare completamente entrambe le variabili allo stesso tempo.

Questa è la base ottica del degrado delle immagini descritto in termini pratici in Perché le piastre Petri in plastica possono compromettere l’imaging a fluorescenza. L’aberrazione sferica, la perdita di risoluzione e la riduzione del contrasto che i ricercatori riscontrano quando acquisiscono immagini attraverso la plastica sono la conseguenza diretta del mancato rispetto, da parte del substrato, delle specifiche relative allo spessore del coprioggetto e all’indice di rifrazione da cui dipendono gli obiettivi.

Come FluoroDish™ soddisfa lo standard

Le piastre per colture cellulari FluoroDish™ di WPI sono prodotte con un fondo in vetro di qualità ottica, adatto allo spessore standard dei vetrini coprioggetto (~ 170 µm) e con l’indice di rifrazione del vetro borosilicato. Ciò significa che il substrato soddisfa entrambe le specifiche richieste dagli obiettivi con NA elevata.

In pratica, ciò garantisce la piena compatibilità ottica con l’intera gamma di obiettivi ad alte prestazioni utilizzati nella moderna microscopia a fluorescenza [plan-apocromatici, obiettivi a immersione in olio e lenti a correzione fissa usate per TIRF e le tecniche di super-risoluzione]. Non è necessario regolare l’anello di correzione. Non serve compensare l’indice di rifrazione. L’obiettivo offre le prestazioni previste dal suo progettista.

FluoroDish™ utilizza anche un adesivo biocompatibile e privo di citotossine per fissare il fondo in vetro, rendendolo sicuro per embrioni, cellule primarie e modelli derivati da iPSC. Disponibile in più formati e compatibile con rivestimenti superficiali come collagene, poli-D-lisina e fibronectina, supporta un’ampia gamma di flussi di lavoro sperimentali nelle applicazioni di imaging accademiche, CRO e farmaceutiche.

→ Per indicazioni sulla scelta della piastra giusta per la tua specifica applicazione di microscopia, consulta Come scegliere la piastra per colture cellulari giusta per la microscopia.

 

DETTAGLI FLUORODISH™

Domande frequenti

Cosa indica 0.17 su un obiettivo da microscopio?
Il numero 0.17 stampato su un obiettivo da microscopio indica lo spessore consigliato del vetrino coprioggetto, in millimetri, ossia il substrato attraverso cui l’obiettivo è stato corretto otticamente per acquisire immagini. Gli obiettivi con NA elevata sono progettati in base a questa specifica, con elementi interni delle lenti calcolati per compensare la rifrazione introdotta da 0.17mm di vetro borosilicato. L’uso di un substrato con spessore o indice di rifrazione diverso introduce aberrazione sferica, che l’obiettivo non può correggere autonomamente.

Cosa succede se uso un vetrino coprioggetto dello spessore sbagliato?
L’uso di un substrato più spesso, più sottile o con uno spessore più variabile di 0.17mm introduce aberrazione sferica. Si tratta di una condizione in cui i raggi luminosi che entrano nell’obiettivo con angolazioni diverse si concentrano in punti leggermente diversi. Le conseguenze pratiche includono una riduzione della risoluzione laterale e assiale, una perdita di intensità del segnale, un aumento del fondo e uno spostamento del piano focale. Questi effetti sono più marcati con aperture numeriche elevate, per le quali la correzione dell’obiettivo dipende strettamente dalle specifiche del substrato.

Posso usare un anello di correzione per compensare lo spessore di una piastra in plastica?
No, non in modo efficace. Gli anelli di correzione possono compensare le variazioni dello spessore del substrato entro un intervallo limitato, in genere da 0.14mm a 0.20mm. Le piastre standard in plastica hanno una base spessa da 1mm a 2mm, ben oltre questo intervallo, e non è possibile correggerne lo spessore. Inoltre, gli anelli di correzione non compensano la differenza nell’indice di rifrazione: il polistirene ha un indice di rifrazione di circa 1.59, rispetto a 1.515 del vetro borosilicato, e questa differenza persiste indipendentemente dalla regolazione dell’anello.

Perché gli obiettivi a immersione in olio richiedono un vetro dello spessore di un coprioggetto?
Gli obiettivi a immersione in olio sono progettati per ottenere una corrispondenza specifica dell’indice di rifrazione tra l’olio di immersione (n ≈ 1.515) e il vetro borosilicato (n ≈ 1.515). Questa corrispondenza riduce al minimo la rifrazione all’interfaccia tra l’obiettivo e il substrato e consente al sistema di correzione interno dell’obiettivo di funzionare come previsto. Quando lo spessore o l’indice di rifrazione del materiale del substrato differiscono da quelli del vetro borosilicato, la corrispondenza viene meno e l’aberrazione sferica aumenta. Gli obiettivi a immersione in olio operano con le aperture numeriche più elevate e sono quindi i più sensibili a questa differenza.

Le piastre con fondo in vetro sono compatibili con gli obiettivi apocromatici?
Sì, purché il fondo in vetro sia prodotto con uno spessore da coprioggetto (~170 µm) e il corretto indice di rifrazione. FluoroDish™ soddisfa entrambe le specifiche ed è quindi pienamente compatibile con gli obiettivi plan-apocromatici, comprese le lenti a immersione in olio usate per la microscopia confocale, TIRF e di super-risoluzione. Non è necessario regolare l’anello di correzione.

Lo spessore del coprioggetto influisce allo stesso modo su tutte le tecniche di microscopia?
No. Le tecniche a basso ingrandimento e con obiettivi a bassa apertura numerica sono relativamente tolleranti alle variazioni dello spessore del substrato. La specifica diventa fondamentale con gli obiettivi a immersione in olio ad alta apertura numerica, usati nella microscopia confocale, nella TIRF, nelle tecniche di super-risoluzione e nell’imaging a fluorescenza dettagliato. Queste tecniche operano ai limiti di risoluzione definiti dall’apertura numerica dell’obiettivo e l’aberrazione sferica dovuta a uno spessore del substrato non corretto riduce direttamente la risoluzione e la qualità del segnale ottenibili a quei limiti.