Come scegliere la piastra per colture cellulari più adatta alla microscopia

Scegliere una piastra per coltura cellulare per l’imaging è tanto una decisione ottica quanto biologica. Il materiale della piastra, il diametro del fondo in vetro, la geometria delle pareti e il rivestimento superficiale influiscono sulle prestazioni del microscopio, sulla qualità del campione e sulla manutenzione. Questa guida illustra i criteri di selezione principali e abbina ogni formato FluoroDish™ ai flussi di lavoro per cui è più indicato.

Inizia con quattro domande

Prima di scegliere una piastra, chiarisci i requisiti del tuo esperimento. Quattro domande riguardano le variabili più importanti:

1. Quale tecnica di microscopia stai usando? La fluorescenza in campo largo, la microscopia confocale, la TIRF, la super-risoluzione e l’imaging time-lapse di cellule vive pongono requisiti diversi al substrato. Le tecniche avanzate richiedono piastre con fondo in vetro adatte allo spessore del coprioggetto. Alcuni flussi di lavoro tollerano la plastica, ma la maggior parte delle tecniche di imaging di precisione no.

2. Quale obiettivo stai usando? Gli obiettivi a immersione in olio ad alto ingrandimento, standard per la microscopia confocale, TIRF e super-risoluzione, sono corretti otticamente per vetro borosilicato da 170 µm. Se le specifiche del tuo obiettivo indicano uno spessore del coprioggetto di 0.17mm, la piastra deve rispettare tale specifica.

3. Su quale tipo di cellula o modello stai lavorando? Le cellule primarie, i modelli derivati da iPSC, gli embrioni e altri sistemi sensibili hanno requisiti specifici di adesione e biocompatibilità. Anche la scelta del rivestimento superficiale e la biocompatibilità dell’adesivo sono importanti.

4. Ci sono requisiti specifici del flusso di lavoro? La produttività, il volume di terreno disponibile, l’accesso per la microiniezione e il campo visivo influiscono tutti sulla scelta del formato. Una piastra otticamente corretta ma geometricamente inadatta al flusso di lavoro crea problemi pratici che le prestazioni ottiche non possono compensare.

Prima di tutto il materiale: vetro o plastica?

Se la qualità dell’imaging influisce sulle conclusioni scientifiche, usa il vetro.
Le piastre di plastica (in particolare quelle in polistirene) introducono due problemi ottici concomitanti: 

• Spessore e indice di rifrazione diversi da quelli previsti per il coprioggetto, richiesti dagli obiettivi ad alto ingrandimento
  
• Autofluorescenza che aggiunge segnale di fondo nella gamma di eccitazione blu-verde. 

Questi problemi sono particolarmente dannosi nella quantificazione della fluorescenza, nei pannelli multiplex, nei saggi con reporter a bassa espressione e in tutti gli esperimenti in cui l’accuratezza del segnale o la risoluzione spaziale sono requisiti fondamentali.

Le piastre con fondo in vetro prodotte con lo spessore dei vetrini coprioggetto (~170 µm) eliminano entrambi i problemi alla radice. Soddisfano le specifiche del substrato richieste dagli obiettivi ad alto ingrandimento e producono un’autofluorescenza trascurabile in tutto lo spettro visibile.

La plastica resta adatta alla normale espansione cellulare, allo screening ad alta processività quando la risoluzione delle immagini non è fondamentale e ai flussi di lavoro in cui costi e produttività prevalgono sulle prestazioni ottiche.

→ Per un confronto completo delle proprietà ottiche di vetro e plastica, consulta Piastre per colture cellulari in vetro o in plastica: quali sono le migliori per l’imaging?

→ Per una spiegazione dettagliata di come la plastica distorce le immagini a fluorescenza, consulta Perché le piastre Petri in plastica distorcono le immagini a fluorescenza

→ Per approfondire i principi ottici alla base della compatibilità con lo spessore dei vetrini coprioggetto, consulta Perché lo spessore del vetrino coprioggetto è importante in microscopia

Scegliere la piastra in base alla tecnica di microscopia

Le diverse tecniche di imaging impongono requisiti diversi al substrato. Ecco una panoramica delle caratteristiche da considerare per ciascuna tecnica:

Microscopia a fluorescenza in campo largo: le piastre con fondo in vetro sono vivamente consigliate per qualsiasi applicazione quantitativa o multiplexata di microscopia a fluorescenza in campo largo. Per acquisizioni qualitative a minore ingrandimento, la plastica può essere accettabile, ma sarà presente un fondo di autofluorescenza, che va considerato nell’analisi delle immagini. Consigliate: FD35 o FD5040 FluoroDish™, a seconda del campo visivo richiesto.

Microscopia confocale (scansione puntuale e disco rotante): i sistemi confocali vengono solitamente utilizzati con obiettivi a immersione in olio ad alto ingrandimento, corretti per vetro da 0,17 mm. Per ottenere prestazioni ottiche ottimali sono necessarie piastre con fondo in vetro conformi a queste specifiche. Alle maggiori risoluzioni comunemente utilizzate nella microscopia confocale, le piastre in plastica introducono aberrazione sferica. Consigliate: FD35 FluoroDish™ per le applicazioni standard e FD5040 FluoroDish™ per acquisizioni su aree ampie o con immagini affiancate.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF): la TIRF genera un’onda evanescente all’interfaccia vetro-acqua e richiede un substrato di spessore e indice di rifrazione precisi per funzionare correttamente. Per la TIRF, le piastre con fondo in vetro dello stesso spessore del vetrino coprioggetto non sono facoltative: sono un requisito tecnico. Le piastre in plastica sono incompatibili con la TIRF. Consigliata: FD35 FluoroDish™.

Microscopia a super-risoluzione (STORM, PALM, STED): le tecniche di super-risoluzione operano al limite di diffrazione o oltre e sono molto sensibili a qualsiasi fonte di aberrazione o fondo. Sono necessarie piastre con fondo in vetro. Qualsiasi scostamento dalle specifiche del borosilicato da 0.17mm riduce la risoluzione che queste tecniche sono progettate per raggiungere. Consigliata: FD35 FluoroDish™.

Imaging time-lapse di cellule vive: le sessioni di imaging prolungate richiedono stabilità termica oltre che prestazioni ottiche. Le piastre con fondo in vetro si equilibrano più rapidamente con gli incubatori montati sul tavolino e mantengono una distribuzione della temperatura più uniforme rispetto a quelle in plastica. Negli esperimenti di più ore, questo influisce sia sulla salute cellulare sia sull’affidabilità delle misurazioni biologiche. Consigliate: FD35 FluoroDish™ per il time-lapse standard; FD5040 FluoroDish™ per popolazioni cellulari più numerose o esperimenti con un campo visivo più ampio.

Scelta del formato: abbinare le dimensioni della piastra al flusso di lavoro

Una volta scelto il materiale, il formato viene determinato dal campo visivo, dalle dimensioni della popolazione cellulare e dai requisiti specifici del flusso di lavoro.

FD35 – (Piastra da 35 mm, pozzetto da 23 mm) È la scelta standard per la maggior parte delle applicazioni di imaging. Il fondo in vetro da 23 mm è adatto alle densità di semina cellulare più comuni e offre un campo visivo sufficiente per l’imaging di singole cellule e popolazioni cellulari con tutte le tecniche di microscopia standard. Compatibile con gli inserti per il tavolino e le camere ambientali comunemente usati nelle configurazioni per l’imaging di cellule vive.

FD5040 – (Piastra da 50 mm, pozzetto da 40 mm) Per gli esperimenti in cui il campo visivo o le dimensioni della popolazione cellulare sono determinanti nella scelta di un formato più grande, scegliete FD5040. È adatta all’acquisizione confocale con scansione a mosaico, all’imaging a fluorescenza su aree estese, alla coltura di organoidi e agli esperimenti che richiedono una maggiore superficie senza compromettere le prestazioni ottiche. Il fondo in vetro da 40 mm offre un’area di imaging significativamente più ampia, mantenendo la piena compatibilità con lo spessore del coprioggetto.

Formati multi-pozzetto per applicazioni ad alta produttività – Gli esperimenti che prevedono più condizioni, i test di risposta alla dose o i flussi di lavoro di screening in cui è necessario acquisire immagini di più campioni in un’unica sessione richiedono soluzioni diverse. I formati di piastre a 24 e 96 pozzetti offrono un’efficienza di produttività impossibile da ottenere con singole piastre. Per queste applicazioni sono disponibili le piastre multi-pozzetto Corning. Si noti che le prestazioni di imaging dei formati multi-pozzetto in plastica sono soggette agli stessi limiti ottici delle normali piastre in plastica. Per ottenere immagini di fluorescenza di qualità, è necessario specificare piastre multi-pozzetto con fondo in vetro.

L’FD3510: quando la geometria conta

Per la maggior parte delle applicazioni di imaging, FD35 e FD5040 soddisfano i requisiti di formato. L’FD3510 è pensata per due flussi di lavoro specifici, a cui nessuna delle due piastre standard è adatta.

• Microiniezione: l’FD3510 FluoroDish™ è dotata di un pozzetto centrale da 10mm con una parete interna inclinata appositamente. L’inclinazione è progettata per allinearsi all’angolo di avvicinamento dei sistemi di microiniezione standard, guidando il posizionamento della micropipetta in modo uniforme e riducendo le regolazioni manuali necessarie per ottenere il corretto angolo di ingresso. Per i ricercatori che eseguono iniezioni intracellulari, procedure di fecondazione in vitro o manipolazioni di embrioni, questa geometria semplifica un flusso di lavoro tecnicamente impegnativo e migliora la riproducibilità delle iniezioni.
  

• Risparmio di terreni e reagenti: il pozzetto da 10mm contiene un volume notevolmente inferiore rispetto a un pozzetto standard da 23mm. Negli esperimenti che utilizzano coloranti fluorescenti costosi, terreni per cellule primarie rare, fattori di segnalazione specializzati o qualsiasi reagente il cui costo o la cui disponibilità impongano di limitarne il volume, l’FD3510 riduce la quantità necessaria a coprire le cellule senza compromettere le prestazioni di imaging. Per i team CRO e farmaceutici che gestiscono i costi dei reagenti su un elevato numero di esperimenti, questo rappresenta un vantaggio pratico significativo.
  L’FD3510 mantiene lo stesso fondo in vetro di grado ottico, le stesse specifiche di spessore del coprioggetto e lo stesso adesivo biocompatibile degli altri modelli della gamma FluoroDish™. La differenza sta nella geometria, non in un compromesso sulle prestazioni ottiche.
  

Rivestimenti superficiali: abbinare il substrato al tipo di cellule

La superficie di vetro del fondo scelta influisce su più aspetti delle proprietà ottiche. Influenza direttamente l’adesione, la morfologia e la vitalità cellulare. Per i tipi di cellule che non aderiscono facilmente al vetro non rivestito, i rivestimenti superficiali sono essenziali.

La scelta del rivestimento dipende dal tipo di cellule, dai requisiti sperimentali e dalla possibilità che il rivestimento stesso interferisca con il segnale di imaging. Tra le opzioni più comuni ci sono collagene, poli-D-lisina, fibronectina e vitronectina, ciascuna adatta a diversi tipi di cellule e condizioni di coltura.

→ Per una guida completa ai rivestimenti disponibili e a come abbinarli al tipo di cellule, consulta Come scegliere il rivestimento giusto per la piastra di coltura.

Riferimento ai formati FluoroDish™

SKU	Diametro esterno	Diametro del pozzetto	Geometria della parete	Ideale per
FD35	35mm	23mm	Dritta	Fluorescenza standard, microscopia confocale, TIRF, super-risoluzione, acquisizione in time-lapse di cellule vive
FD3510	35mm	10mm	Inclinata	Microiniezione, risparmio di terreni/reagenti costosi
FD5040	50mm	40mm	Dritta	Imaging di aree ampie, acquisizione a mosaico, coltura di organoidi, popolazioni cellulari più numerose

 

Tutti i formati FluoroDish™ sono dotati di vetro di qualità ottica dello spessore dei coprioggetto (~170 µm), autofluorescenza trascurabile e adesivo biocompatibile privo di citotossicità. Sono compatibili con rivestimenti superficiali, tra cui collagene, poli-D-lisina, poli-L-lisina, fibronectina e vitronectina.

 

DETTAGLI FLUORODISH

 

Domande frequenti

Qual è la piastra per colture cellulari migliore per la microscopia confocale? 
Per la microscopia confocale con obiettivi a immersione in olio ad alto ingrandimento sono necessarie piastre con fondo in vetro dello spessore dei coprioggetto (~170 µm). Questi obiettivi sono corretti otticamente per il vetro borosilicato di questo spessore. Le piastre in plastica non rispettano queste specifiche né per lo spessore né per l'indice di rifrazione e introducono aberrazione sferica, riducendo la risoluzione e la qualità del segnale. FluoroDish™ FD35 è la scelta standard per la maggior parte delle applicazioni confocali. FD5040 è consigliata per l'acquisizione di aree ampie o a mosaico.

Quale piastra per colture cellulari dovrei usare per la microscopia TIRF? 
La microscopia TIRF richiede un substrato di vetro con spessore e indice di rifrazione precisi per generare correttamente l'onda evanescente. Per la TIRF, le piastre con fondo in vetro dello stesso spessore dei coprioggetto sono un requisito tecnico. Le piastre in plastica non sono compatibili. FluoroDish™ FD35 rispetta le specifiche del substrato richieste dagli obiettivi TIRF.

Posso usare una piastra a 96 pozzetti per l'imaging in fluorescenza? 
Sì, con importanti riserve. Le piastre standard a 96 pozzetti in polistirene generano autofluorescenza e non sono compatibili con obiettivi ad alto ingrandimento. Per l'imaging in fluorescenza con piastre multi-pozzetto, la scelta appropriata è una piastra a 96 pozzetti con fondo in vetro. Per lo screening di routine, quando la risoluzione dell'imaging non è il requisito principale, le piastre standard possono essere adatte, a seconda della sensibilità del test.

Qual è la piastra migliore per la microiniezione? 
FluoroDish™ FD3510 è progettato specificamente per le procedure di microiniezione. Il pozzetto centrale da 10mm presenta una parete interna inclinata, progettata per allinearsi agli angoli di approccio standard delle micropipette e migliorare la costanza e la riproducibilità del posizionamento. Il volume ridotto del pozzetto consente inoltre di risparmiare terreni e reagenti costosi. Il fondo in vetro di qualità ottica mantiene la piena compatibilità con l'imaging per la verifica della fluorescenza dopo l'iniezione.

Il rivestimento superficiale influisce sulla qualità delle immagini? 
I rivestimenti superficiali possono influire sull’imaging se introducono autofluorescenza o modificano l’indice di rifrazione all’interfaccia tra cellula e substrato. La maggior parte dei rivestimenti biologici standard, come collagene, poli-D-lisina e fibronectina, ha un impatto ottico trascurabile alle concentrazioni di rivestimento tipiche. La considerazione principale è scegliere un rivestimento adatto al tipo cellulare per ottimizzare l’adesione e la morfologia, più che le prestazioni ottiche. Per indicazioni dettagliate, consulta Come scegliere il rivestimento giusto per la piastra di coltura.

Di quale formato di piastra con fondo in vetro ho bisogno per l’imaging di cellule vive? 
La scelta del formato per l’imaging di cellule vive dipende dal campo visivo richiesto e dalle dimensioni della popolazione cellulare studiata. FD35, con il suo pozzetto da 23 mm, è adatto alla maggior parte delle applicazioni standard di time-lapse ed è compatibile con i comuni incubatori da tavolino e le camere ambientali. FD5040, con il suo pozzetto da 40 mm, è la scelta migliore per popolazioni più ampie, colture di organoidi o esperimenti che richiedono un’area di imaging più estesa. Entrambi i formati offrono la conducibilità termica e le prestazioni ottiche necessarie per le lunghe sessioni di time-lapse.

Quando dovrei scegliere FD5040 invece di FD35? 
FD5040 è la scelta giusta quando il campo visivo o la superficie sono il fattore determinante. È particolarmente adatto per l’acquisizione confocale con scansione a mosaico su un’area estesa, per esperimenti con un’elevata densità cellulare o colture di organoidi e per flussi di lavoro in cui serve una maggiore area di imaging senza compromettere le prestazioni ottiche. Per la maggior parte delle applicazioni standard di imaging di singole cellule o popolazioni cellulari, FD35 è sufficiente.

Conclusione

La scelta della piastra per colture cellulari più adatta alla microscopia dipende da quattro variabili: materiale, compatibilità con l’obiettivo, formato e rivestimento superficiale. Per qualsiasi esperimento in cui la qualità delle immagini incide sulle conclusioni scientifiche, le piastre con fondo in vetro, realizzate con lo spessore di un vetrino coprioggetto, sono il substrato corretto. La scelta del formato dipende dalle esigenze pratiche del flusso di lavoro. FD35 è ideale per le applicazioni standard, FD5040 è adatto all’imaging di aree estese e FD3510 è progettato per la microiniezione e il risparmio di reagenti. Il rivestimento superficiale mette in relazione il substrato ottico con le esigenze biologiche del tipo cellulare. Prendere correttamente tutte e quattro le decisioni elimina il substrato dalle variabili e consente al microscopio e alla ricerca di dare i risultati previsti.