Automazione e ottimizzazione

Gli astrociti umani primari (iXCells 10HU-035) sono stati scongelati in terreno Eagle modificato da Dulbecco (DMEM; 10-013-CM) supplementato con il 10% di siero fetale bovino (FBS; 35-010-CV) e mantenuti in fiasche rivestite con collagene I Corning® BioCoat® (354486). Una banca di lavoro di cellule crioconservate è stata utilizzata dopo il recupero dallo scongelamento o dopo un singolo passaggio in una nuova fiasca rivestita di collagene. La linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC®; CRL-2266) è stata mantenuta in DMEM supplementato con il 10% di FBS. Le cellule hCMEC/D3 (MilliporeSigma; SCC066) sono state coltivate in fiasche rivestite con collagene I Corning® BioCoat® in EBM-2 (Lonza; 3156) supplementato con EGM-2 MV (Lonza; 4147), con l’aggiunta del 2,5% di FBS e dell’1% di concentrato lipidico modificato chimicamente (Thermo Scientific; 11905031).

Diverse combinazioni di colture singole, co-colture e tri-colture sono state allestite utilizzando supporti permeabili Corning® HTS Transwell® a 24 pozzetti (3379) con pori da 0,4 μm. Per gli inserti coltivati con astrociti, una goccia da 50 μL di Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix a 100 μg/mL, diluita in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 21-040-CM), è stata applicata sul lato inferiore dell’inserto capovolgendo la piastra sul coperchio. Gli inserti sono stati incubati per un’ora sotto cappa a flusso laminare, quindi il liquido è stato aspirato e sono stati seminati gli astrociti. Gli astrociti sono stati raccolti con Accutase® Cell Detachment Solution (25-058-CI) e risospesi in DMEM contenente il 10% di FBS, a una densità di 264.000 cellule/mL. Su ciascun inserto capovolto è stata aggiunta una goccia da 50 μL contenente cellule (75.000 cellule/cm2); le cellule sono state lasciate aderire per un’ora prima di riportare la piastra nella posizione di coltura standard e aggiungere 200 μL agli inserti e 500 μL al pozzetto ricevente di DMEM con il 10% di FBS. Lo stesso giorno, le piastre riceventi (3524), contenenti cellule SH-SY5Y, sono state seminate con cellule raccolte con Accutase® alla densità di 10.000 cellule/cm2 in 500 μL di DMEM contenente il 10% di FBS. Le colture di astrociti e SH-SY5Y sono state incubate separatamente per circa 72 ore prima dell’aggiunta di hCMEC/D3. Le cellule hCMEC/D3 sono state raccolte con Accutase e seminate negli inserti, con o senza astrociti, alla densità di 40.000 cellule/cm2 in 300 μL di terreno per il test hCMEC/D3. Il terreno per il test hCMEC/D3 era costituito da EBM-2 integrato con EGM (Lonza; 4133) senza estratto di cervello bovino, con un ulteriore 3% di FBS e l’1% di concentrato lipidico modificato chimicamente. Gli inserti sono stati abbinati a piastre per colture cellulari con o senza cellule SH-SY5Y, utilizzando 1 mL di terreno per il test hCMEC/D3 nella piastra per colture cellulari sottostante. Il terreno è stato sostituito a giorni alterni. Quarantotto ore dopo l’aggiunta di hCMEC/D3, alcune colture sono state sottoposte a condizioni di taglio mediante un agitatore orbitale Corning® LSE™ a bassa velocità (6780-FP) impostato a 50 RPM. La TEER è stata misurata ogni giorno dopo l’aggiunta delle cellule hCMEC/D3 utilizzando lo strumento World Precision Instruments EVOM™ AUTO (EVA-MT-03-02).

I monostrati di 24 HTS sono stati fissati aspirando il terreno di coltura e sostituendolo con 500 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% (Boston BioProducts; BM-155) per inserto e 1 mL per piastra di coltura cellulare. Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, gli inserti sono stati lavati con lo stesso volume di PBS. I monostrati sono stati quindi permeabilizzati con Triton X allo 0,1% (Integra Chemical Company; T756.30.30) per 15 minuti e lavati nuovamente con PBS. I monostrati sono stati poi bloccati con albumina sierica bovina (MilliporeSigma; A9576) al 2% in PBS durante la notte a 2-8 ºC. Il giorno seguente, le cellule sono state lavate con PBS e i monostrati sono stati colorati con 100 μL di ZO-1 (Invitrogen; 740002MP647) diluito 1:1000 durante la notte a 2-8 ºC.

Dopo l’ottimizzazione nei supporti permeabili Corning® HTS Transwell® a 24 pozzetti, lo stesso protocollo è stato applicato ai supporti permeabili Corning® HTS Transwell® 96 da 0,4 μm (7369), utilizzando solo le condizioni Astrociti con hCMEMC/D3 e SH-SY-5Y con hCMEMC/D3. Il volume di rivestimento con Matrigel e di semina degli astrociti sul lato inferiore degli inserti è stato ridotto a 22 μL per inserto e le concentrazioni sono state regolate per mantenere la stessa quantità di μg o di cellule per cm2. Dopo l’adesione degli astrociti, sono stati aggiunti 100 μL di DMEM con FBS al 10% a ciascun inserto e 200 μL a ciascun pozzetto ricevente. Inoltre, le cellule SH-SY-5Y sono state seminate nelle piastre riceventi Corning HTS Transwell-96 (3382), in 200 μL per pozzetto. Il flusso è stato applicato a tutti gli inserti dopo 48 ore dall’adesione di hCMEC/D3. La TEER è stata misurata ogni giorno utilizzando la matrice di elettrodi EVA-MT-03-01.

Circa 120 ore dopo l’aggiunta di hCMEC/D3, il terreno è stato aspirato dai supporti permeabili Corning® HTS Transwell® 96 e sostituito con Lipopolisaccaride (LPS; Invitrogen; 00-4976-93), Insulina (Thermo Scientific; 12585014), TNF alfa (Thermo Scientific; 300-01A-500 μg) diluiti in serie oppure con il terreno come controllo negativo. I composti sono stati incubati con le colture su un agitatore per 48 ore, misurando quotidianamente il TEER.

Figura 1: Lo sforzo di taglio aumenta l’integrità della barriera emato-encefalica. A. Dopo cinque giorni in condizioni statiche, quando le cellule vengono coltivate su piastre Transwell in assenza di sforzo di taglio indotto dalla gravità, le cellule hCMEC/D3 mostrano valori di TEER superiori a quelli degli astrociti, sia quando vengono coltivate da sole sia quando sono coltivate insieme ad astrociti e/o cellule di neuroblastoma (SH-SY5Y). B.

La TEER è una tecnica analitica non distruttiva che fornisce una misura funzionale dell’integrità della barriera e può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti nei modelli di tessuti 2D e 3D e correlare i fenomeni in vitro e in vivo.

Figura 2: l’immunoistochimica per ZO-1 mostra un aumento delle giunzioni strette e dell’integrità della barriera ematoencefalica nelle cellule hCMEC/D3 sottoposte a stress da taglio. Immagini rappresentative di diverse combinazioni cellulari su supporti permeabili, coltivate in condizioni statiche (riga superiore) o in condizioni di flusso (riga inferiore). Colture fissate all’8º giorno. Immagini acquisite con un microscopio confocale a scansione laser Leica Stellaris 5, dotato di un obiettivo a immersione in olio 40x/1.3 NA. Scala: 20 μm.

Figura 3: i modelli di BBB coltivati in piastre HTS a 96 pozzetti mostrano un aumento dell’integrità della barriera e una diminuzione della permeabilità, misurate tramite TEER nell’arco di 5 giorni. Valori medi delle misurazioni TEER di tre repliche tecniche per esperimento e di tre esperimenti indipendenti, dopo la sottrazione del fondo dei transwell senza cellule (solo terreno di coltura). Dati presentati con errore standard. L’analisi statistica ha rilevato p<0.05, come indicato con *, utilizzando un test t non appaiato a due code.Figura 4: LPS aumenta la permeabilità della BBB. Effetto dell’LPS. Valore medio delle misurazioni TEER delle colture esposte a concentrazioni crescenti di LPS per 48 ore. I dati rappresentano la media di tre repliche tecniche per esperimento e di tre esperimenti indipendenti, con errore standard. ANOVA con test post hoc di Dunnett rispetto al solo terreno di coltura. *=p<0.05, **=p<0.005, ***=p<0.001 ****=p<0.0001.Effetto dell’insulina. Valore medio delle misurazioni TEER delle colture esposte a concentrazioni crescenti di insulina per 48 ore. I dati rappresentano la media di tre repliche tecniche per esperimento e di tre esperimenti, con errore standard. ANOVA con test post hoc di Dunnett rispetto al solo terreno di coltura. *=p<0.05, **=p<0.005, ***=p<0.001 ****=p<0.0001.Effetto del TNF-α. Valore medio delle misurazioni TEER delle colture esposte a concentrazioni crescenti di TNF-α per 48 ore. I dati rappresentano la media di tre repliche tecniche per esperimento e di tre esperimenti, con errore standard. ANOVA con test post hoc di Dunnett rispetto al solo terreno di coltura. *=p<0.05, **=p<0.005, ***=p<0.001 ****=p<0.0001.

L’aggiunta di forze di taglio mediante uno shaker orbitale a bassa velocità e/o di ulteriori tipi cellulari rilevanti per la BBB, come astrociti primari o cellule SH-SY5Y, può aumentare in modo statisticamente significativo i valori di TEER rispetto alle barriere hCMEC/D3 coltivate in condizioni statiche.

La colorazione immunocitochimica mostra un allineamento più lineare delle cellule hCMEC/D3 coltivate in condizioni di taglio.

L’EVOM™ Auto automatizza in modo rapido e riproducibile le misurazioni della TEER nei monostrati endoteliali coltivati su supporti permeabili Corning Transwell a 24 e 96 pozzetti. La possibilità di monitorare l’integrità della barriera in modo asettico e non distruttivo consente ai ricercatori di utilizzare efficacemente la TEER come misurazione in tempo reale della permeabilità negli studi longitudinali a lungo termine, riducendo costi e variabilità.

La combinazione di EVOM Auto e dei supporti permeabili Corning Transwell consente di ottimizzare facilmente i modelli di barriera e di eseguire saggi a maggiore throughput.