NOTA APPLICATIVA: la tecnologia TEER consente un flusso di lavoro in vitro ottimizzato per la scoperta di farmaci

Workflow ottimizzato in vitro per identificare composti con proprietà vasoattive

I modelli in vitro hanno utilizzato due metodi comuni per quantificare le variazioni dell’integrità della barriera endoteliale: la resistenza elettrica trans-epiteliale/trans-endoteliale (TEER) e la permeabilità a composti traccianti.¹  La TEER è un metodo non invasivo che quantifica le variazioni della conduttanza elettrica per misurare la confluenza cellulare e l’integrità della barriera. La permeabilità ai composti traccianti utilizza molecole di peso molecolare definito per misurare la capacità di esclusione dimensionale delle barriere cellulari (ad es., FITC-destrano da 4 kDa o FD4).¹  Utilizzando EVOM™ Manual (EVOM-MT-03-01) con l’elettrodo TEER EndOhm e supporti permeabili per colture cellulari, questa nota applicativa descrive come valutare in modo non invasivo l’integrità della barriera endoteliale dopo il trattamento con citochine e fornisce un metodo per identificare composti vasoattivi potenzialmente in grado di indurre danni vascolari.  Gli studi sulla permeabilità ai composti traccianti vengono combinati con la valutazione TEER per chiarire gli effetti del trattamento sia sulle giunzioni intercellulari sia sul trasporto paracellulare (Fig. 1).

Fig. 1– Workflow per misurare l’attivazione endoteliale mediante saggi TEER e di permeabilità ai traccianti.

Il danno vascolare indotto da farmaci (DIVI) si verifica quando i composti vasoattivi danneggiano il vaso endoteliale e il muscolo liscio circostante, causando infiammazione e lo sviluppo di lesioni vascolari.²  Il DIVI è difficile da prevedere e può essere indotto da farmaci appartenenti a diverse classi e categorie specifiche per determinate patologie.³  La tossicità farmacologica associata al DIVI riguarda circa il 2,5% dei nuovi candidati farmaci, rendendo fondamentale identificare precocemente i composti vasoattivi nello sviluppo preclinico dei farmaci.⁴

L’attivazione delle cellule endoteliali (EC) è un passaggio precursore importante del DIVI.⁵  Le EC assumono questo fenotipo pro-infiammatorio in risposta a patologie (ad es., sepsi, febbre emorragica virale), citochine, forze meccaniche esterne o trattamenti farmacologici.⁶ L’attivazione delle EC danneggia e altera l’integrità del vaso endoteliale, determinando variazioni della permeabilità vascolare, del tono vasomotorio e dell’espressione di biomarcatori (ad es., E-selectina, P-selectina, ICAM1, VCAM1).⁷  La permeabilità vascolare è regolata da un sistema di giunzioni intercellulari che comprende giunzioni strette (TJs) e giunzioni aderenti (AJs).⁸  Queste interazioni proteina-proteina formano una barriera a permeabilità selettiva che favorisce il trasporto paracellulare e mantiene l’integrità vascolare.⁹  Quando le cellule endoteliali vengono attivate in risposta al trattamento con composti vasoattivi, possono formarsi fessure endoteliali focali a causa di cambiamenti nell’organizzazione delle proteine delle giunzioni strette.  Queste fessure alterano l’integrità della barriera e le dimensioni dei pori delle giunzioni intercellulari, provocando una permeabilità endoteliale disregolata o una maggiore «permeabilità» vascolare.⁸

Per creare un modello in vitro per misurare l’attivazione delle cellule endoteliali, cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state seminate in inserti per colture cellulari a una densità di 6 x 104 cellule/cm2 (Fig. 1). La TEER è stata misurata per diversi giorni utilizzando EVOM™ Manual con l’elettrodo TEER EndOhm, fino al raggiungimento della confluenza.  Le HUVEC confluenti sono state trattate con 10 o 50 ng/ml di TNF-alpha per 24 ore e misurate mediante TEER. È stato aggiunto un tracciante fluorescente (FITC-destrano da 4 kDa) al compartimento apicale per 1 ora, quindi la quantità di tracciante nel compartimento basolaterale è stata misurata con un lettore di piastre (Ex/Em 495/535).

Fig. 2–Risultati TEER e di permeabilità ai traccianti fluorescenti per HUVEC trattate con TNF-alpha.

EVOM™ Manual con l’elettrodo TEER EndOhm ha rilevato una diminuzione della TEER delle HUVEC dopo 24 ore di trattamento con TNF-alpha; i valori TEER più bassi erano simili per entrambe le dosi, 10 e 50 ng/ml (Fig. 2A).  L’analisi della permeabilità con un tracciante fluorescente ha mostrato che, in questo momento, le HUVEC trattate con 50 ng/ml di TNF-alpha erano più permeabili al tracciante fluorescente rispetto alle cellule trattate con 10 ng/ml (Fig. 2B).  La permeabilità di traccianti paracellulari come il FITC-destrano dipende dalle dimensioni dei pori delle giunzioni strette e dal flusso d’acqua paracellulare, mentre i valori TEER sono influenzati dalla conduttanza ionica.1 Le HUVEC trattate con TNF-alpha mostrano variazioni nella capacità delle giunzioni strette di escludere molecole in base alle dimensioni (permeabilità; Fig. 2B), nonché variazioni del trasporto paracellulare (TEER; Fig. 2A).  Nel loro insieme, questi dati dimostrano come EVOM™ Manual con l’elettrodo EndOhm possa essere utilizzato insieme ai saggi di permeabilità ai traccianti per valutare gli effetti delle citochine sulle giunzioni intercellulari e i cambiamenti negli stati di attivazione endoteliale.

NOTA: Per informazioni sui servizi di ricerca a contratto per valutare gli effetti dei trattamenti farmacologici sull’integrità della barriera endoteliale, contattare SynVivo Inc. all’indirizzo support@synvivobio.com.

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Riferimenti

1. Felix K, Tobias S, Jan H, Nicolas S, Michael M. (2021) Histochem Cell Biol. 156(6):609-616. PMID 34459960
2. Yaseen K, Nevares A, and Tamaki H. (2022) Curr Rheumatol Rep. 24(11):323-336. PMID 36129631
3. Zhang J, Hanig JP, and De Felice AF. (2012) Vascul Pharmacol. 56(1-2):14-25. PMID 21968053
4. CDER U.S. Food and Drug Administration. Innovative Medicines Initiative – TransBioLine Drug-induced Vascular Injury Work Package DDTBMQ000037 Letter of Intent. U.S. Food and Drug, Silver Spring, MD, 2019.
5. Ricard N, Bailly S, Guignabert C, and Simons M. (2021) Nat Rev Cardio. 18:565-580. PMID 33627876
6. Siddal E, Khatri M, and Radhakrishnan J. (2017) Kidney Int. 92(1):37-46. 
7. Frazier KS, Engelhardt JA, et al. (2015) Toxicol Pathol. 43(7):915-934. PMID 25722122
8. Claesson-Welsh L, Dejana E, and McDonald DM. (2021) Trends Mol Med. 27(4):314-331. PMID 33309601
9. Srinivasan B, Kolli AR, et al. (2015) J Lab Autom. 20(2):107-126. PMID 25586998