Misuratore manuale EVOM™ per la misurazione della TEER con registrazione automatica dei dati

La funzione di azzeramento si usa per sottrarre qualsiasi misurazione non proveniente dalla membrana, come le resistenze dell’elettrodo e del fluido.

No, per misurare il TEER è necessario calcolare l’area. Per calcolare il TEER, moltiplicare la resistenza misurata per la superficie appropriata (indicata sotto). Ad esempio, se un inserto da 12 mm misura 565 Ω, il TEER è 565 Ω × 1.13 cm2 = 638.5 Ω- cm2. Ecco le superfici generalmente applicabili ai diversi formati di piastra Transwell/inserto: piastra a 6 pozzetti (inserti da 24 mm) 4.52 cm2, piastra a 12 pozzetti (inserti da 12 mm) 1.13 cm2, piastra a 24 pozzetti (inserti da 6.5 mm) 0.33 cm2, piastra a 96 pozzetti (inserti da 4.3 mm) 0.14 cm2. Per le misurazioni automatizzate del TEER, si consiglia di utilizzare il sistema automatizzato di misurazione del TEER WPI REMS.

Cancella tutti i dati in memoria aprendo le impostazioni, il menu di archiviazione e poi premendo «nuova piastra»: in questo modo eliminerai tutte le letture precedenti. Torna alla schermata principale, apri la schermata di anteprima e seleziona ciascun pozzetto da misurare (la selezione diventa verde), posiziona l'elettrodo e poi avvia la misurazione. Dopo aver misurato i pozzetti selezionati, apri le impostazioni, premi il menu della schermata di archiviazione e poi premi «salva nuovo» per salvare i dati della piastra sull'unità USB.

Dopo l’uso, togliere il manuale EVOM™ dalla cappa a flusso laminare. La volta successiva, accendere la luce UV all’interno della cappa. Dopo aver disinfettato la cappa con la luce UV, spegnerla, quindi spruzzare etanolo o isopropanolo al 70-100% su un tovagliolo di carta e pulire il manuale EVOM™. Non spruzzare l’alcol direttamente sul manuale EVOM™.

Puoi aspettarti di osservare una variazione dei valori grezzi di resistenza. Tuttavia, sottrai i valori del bianco (Transwell vuoto, senza cellule) dai valori del campione (Transwell con cellule). In questo modo, sottrai dai campioni con volume aumentato il valore del bianco con volume aumentato. Pertanto, qualsiasi variazione della resistenza dovuta all'aumento del volume viene esclusa. Usa sempre gli stessi volumi per tutti i campioni di un esperimento.

Deriva: letture che aumentano o diminuiscono continuamente e in modo significativo (in termini di tensione o resistenza) nel tempo. Esempio: a 1000 Ω, la lettura aumenta di 100 Ω al minuto. (Una deriva di 10 Ω/minuto è accettabile.) Una deriva eccessiva può essere causata da variazioni del pH o della temperatura oppure dalla necessità di pulire l'elettrodo.

La deriva può essere causata da diversi fattori.

• Assicurarsi che gli elettrodi siano completamente immersi nella soluzione del terreno di coltura e che la temperatura del liquido nella piastra sia costante, equilibrandola a temperatura ambiente o utilizzando uno scaldapiastra.
• Un'altra causa comune della deriva è la presenza di depositi di componenti del terreno di coltura cellulare sulle punte degli elettrodi.
• Gli elettrodi (le punte) richiedono una pulizia enzimatica periodica (Tergazyme o Enzol), fino a una volta alla settimana, a seconda dell'uso.
• Durante una misurazione, anche gli elettrodi portatili devono essere mantenuti il più possibile immobili.
• Un movimento eccessivo farà oscillare la misurazione.
• Inoltre, in un ambiente con il 5% di CO2, la perdita di CO2 provoca una variazione del pH del terreno di coltura e la lettura della resistenza può cambiare. Questo è rilevante soprattutto nel caso di misurazioni continue per periodi prolungati (ore, anziché pochi minuti).

È noto che la temperatura influisce sui valori TEER. Per ottenere valori uniformi, consigliamo di mantenere una temperatura costante, poiché le misurazioni vengono effettuate in terreni di coltura cellulare o in soluzioni tampone. Consigliamo di utilizzare un bagno termostatico a temperatura fissa per riscaldare il terreno o la soluzione tampone da utilizzare durante l’esperimento. Una temperatura costante del terreno o della soluzione tampone garantisce condizioni sperimentali uniformi. Consigliamo di togliere dall’incubatore la piastra con pozzetti contenente le cellule coltivate sugli inserti di coltura per almeno 20 minuti, così da stabilizzarla a temperatura ambiente prima di effettuare le misurazioni. 

Se si utilizza una camera EndOhm, mantenere la stessa distanza fissa tra l’elettrodo superiore e quello inferiore per ottenere letture uniformi. Se si utilizza un elettrodo a bacchetta (STX2), cercare di tenerlo in posizione verticale durante le misurazioni. Mantenere la stessa posizione degli elettrodi a bacchetta durante l’esperimento dovrebbe consentire di ottenere letture uniformi.

Consigliamo di utilizzare lo stesso liquido, con la stessa concentrazione ionica, sia sul lato apicale (ad esempio, nella parte superiore di un inserto per coltura cellulare) sia sul lato basolaterale (ad esempio, nella parte inferiore dell’inserto per coltura cellulare inserito in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti). Durante la misurazione, se si utilizza una soluzione tampone PBS 1X sul lato apicale, consigliamo di utilizzare una soluzione tampone PBS 1X anche sul lato basolaterale. Consigliamo inoltre di mantenere allo stesso livello entrambi i liquidi (all’interno e all’esterno degli inserti per coltura cellulare), così da ridurre al minimo le differenze di pressione. Durante gli esperimenti, riempire prima il pozzetto/lato apicale con il liquido per evitare che la pressione idrostatica stacchi la membrana dal filtro.

L’utilizzo di volumi costanti del liquido (terreno o soluzione tampone) in tutti gli esperimenti riduce la variabilità dei dati.

Il EVOM2 funziona secondo il principio per cui, una volta misurato il pozzetto che chiamiamo «bianco», questa prima misurazione della resistenza comprende la somma della resistenza degli elettrodi, della distanza tra gli elettrodi e della resistenza dovuta al volume e alla molarità del mezzo liquido. (Le eventuali differenze di carica degli elettrodi vengono annullate dal metodo di misurazione dell’ EVOM2', che inverte la polarità e calcola la media dei risultati.)

Le successive misurazioni periodiche del pozzetto tracciano la crescita della membrana tramite la misurazione della resistenza e, una volta che il grafico della resistenza si è stabilizzato, possiamo dire che la membrana ha raggiunto la confluenza. Il sistema EVOM2 funziona proprio come un amplificatore a morsetto di tensione e un sistema Ussing, ma senza l’apposita camera di Ussing.

Il EVOM2 Il sistema non è preciso quanto un sistema Ussing, ma il suo scopo è determinare se una membrana è confl uente, non eseguire analisi dettagliate. (Con il sistema EVOM2 si possono studiare alcune analisi della permeabilità della membrana, ma come variazione percentuale anziché come variazione assoluta.) EVOM2  system, but as a percent of change rather than an absolute value of change.)

Diverse variabili sperimentali influenzano i risultati TEER, come:

• Temperatura,
• Condizioni e posizionamento degli elettrodi,
• Tipo di cellule e condizioni di coltura,
• Composizione del terreno di coltura

Perché le cellule crescono e formano un monostrato compatto. Inizialmente la TEER è bassa dopo la semina, poi aumenta man mano che le cellule si moltiplicano e coprono gli spazi nella membrana, formando una barriera confluente.

Il TEER è ampiamente utilizzato per valutare la funzione di barriera cellulare e la permeabilità in studi sulla permeabilità e l'assorbimento dei farmaci, nella ricerca sulla barriera emato-encefalica, nei test di tossicità e citotossicità e nel monitoraggio dei tessuti e delle colture cellulari.

No: il TEER non è distruttivo. Consente di effettuare misurazioni ripetute nel tempo per monitorare l’integrità della barriera senza danneggiare le cellule.

TEER elevato → Barriera cellulare forte e integra.

TEER basso → Strato cellulare debole o permeabile.

In alcuni modelli (ad es. cellule alveolari), potrebbe essere necessario un tampone/mezzo per una misurazione accurata.

No. Il TEER è la resistenza normalizzata per l’area di crescita cellulare (Ω·cm²), calcolata a partire dalla lettura della resistenza grezza.

NON tenere l’elettrodo per il cavo. Le connessioni interne potrebbero danneggiarsi gradualmente.

Tieni l’elettrodo nella zona indicata dalla freccia (in plastica).

Limita l’immersione nel liquido o gli spruzzi al livello indicato qui (massimo). Il liquido non deve penetrare all’interno e raggiungere i cavi o i connettori. Puoi pulire il resto dell’elettrodo con un tovagliolo di carta inumidito con isopropanolo o etanolo (non spruzzare direttamente).

Se si verifica un'instabilità a 500 Ω, la lettura passa da 450 a 550 Ω senza stabilizzarsi (nell'intervallo di 500 Ω è accettabile un'instabilità di ±5 Ω). Negli intervalli superiori, a 100 K è accettabile un'instabilità fino a ±1000 Ω. Gli elettrodi che mostrano instabilità potrebbero richiedere una pulizia enzimatica.

• Le cause più comuni dell'instabilità delle letture possono essere risolte immergendo completamente le punte nella soluzione o effettuando una pulizia enzimatica.
• Le punte degli elettrodi non sono completamente immerse in una quantità adeguata di liquido conduttivo (terreno di coltura o tampone). Aggiungere altro liquido per portarne il livello all'altezza delle punte degli elettrodi. (Usare volumi apicali e basolaterali costanti per ottenere confronti coerenti.) Sulle punte degli elettrodi (zona di rilevamento) potrebbero essersi depositati componenti del terreno di coltura cellulare; il problema può essere risolto con una pulizia enzimatica.

Sì, abbiamo due serie di EndOhms. I Legacy EVOM2 EndOhms (ENDOHM-6G, ENDOHM-12G, ENDOHM-24G-SNAP) usano il cavo 53330-01, mentre i più recenti EndOhms (EVM-EL-03-01-0x), compatibili con EVOM™ Manual, usano il cavo 99916.