NOTA APPLICATIVA: Osservazione della mitosi con Celloger® Mini Plus

Introduzione

Durante il ciclo cellulare, le cellule crescono e si dividono in due cellule figlie geneticamente identiche. Il ciclo è regolato da una complessa via di segnalazione che mantiene l’omeostasi cellulare regolando la divisione cellulare e la duplicazione del DNA¹. D’altra parte, poiché le cellule tumorali crescono e si dividono indefinitamente, al di fuori del controllo del ciclo cellulare, si utilizzano farmaci antimitotici per sopprimere la proliferazione anomala delle cellule tumorali². In particolare, il nocodazolo è noto come un farmaco antimitotico rappresentativo per il trattamento del cancro e ha la caratteristica di alterare la dinamica dei microtubuli durante la divisione citoplasmatica e nucleare^3,4.

In questo studio abbiamo esaminato l’attività antimitotica del nocodazolo su una linea cellulare tumorale monitorando il processo di divisione cellulare. A tal fine, cellule HeLa sono state trasfettate stabilmente con istone 2B fuso alla proteina fluorescente verde (H2B-GFP), che consente di visualizzare le dinamiche della struttura cromosomica durante la progressione del ciclo cellulare⁵. Successivamente, la divisione cellulare è stata monitorata in tempo reale dopo aver trattato le cellule con o senza nocodazolo, utilizzando Celloger® Mini Plus, un dispositivo per l’imaging di cellule vive.

Metodo

Le cellule HeLa trasfettate con il plasmide H2B-GFP sono state seminate in una piastra a 24 pozzetti alla densità di 4 x 104 cellule/pozzetto. Le cellule sono state coltivate in terreno Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium con il 10% di siero bovino fetale e 300 ug/ mL di G418. Dopo una notte di coltura per consentire alle cellule di aderire, sono state incubate con o senza 62.5 nM di nocodazolo e le immagini in tempo reale sono state acquisite con Celloger® Mini Plus (campo chiaro e canale a fluorescenza verde, ottica 10X). Le immagini sono state acquisite ogni 15 minuti per 24 ore.

Risultati

È stata eseguita l’acquisizione di immagini in time-lapse in campo chiaro e a fluorescenza di cellule HeLa trasfettate con H2B fuso alla proteina fluorescente verde, per osservare i cambiamenti nucleari durante la mitosi. Nell’immagine in campo chiaro, all’inizio la membrana nucleare era chiaramente visibile, poi è gradualmente scomparsa ed è stata osservata la metafase, in cui i cromosomi erano allineati al centro della cellula, sia nelle immagini in campo chiaro sia in quelle a fluorescenza (Figura 1A). In questa fase, i cromosomi erano condensati e la fluorescenza era più intensa rispetto alla fase precedente. I cromosomi entrati nella fase successiva si sono separati in due cromatidi fratelli, ciascuno dei quali si è spostato verso un polo opposto della cellula. Come mostrato nell’ultima immagine, in telofase si sono infine formate due cellule figlie. Al contrario, nelle cellule trattate con nocodazolo, il processo di divisione cellulare non è proseguito, poiché i cromatidi non sono riusciti a separarsi e raggiungere i due poli. Nell’immagine in campo chiaro, le cellule hanno continuato a non aderire al fondo e si è osservato che il DNA si era infine frammentato, provocando apoptosi, come mostrato nell’immagine a fluorescenza (Figura 1B).

Figura 1. Immagini in time-lapse di cellule HeLa trasfettate con H2B-GFP, con o senza nocodazolo.

Conclusione

La marcatura fluorescente è uno strumento utile per osservare le dinamiche degli organelli nelle cellule vive. Finora sono stati sviluppati plasmidi per osservare diversi organelli o proteine bersaglio usando proteine di fusione fluorescenti e sono stati condotti numerosi studi per verificare i cambiamenti degli organelli o la traslocazione delle proteine indotti da diverse stimolazioni.

In questa nota applicativa abbiamo eseguito una procedura di marcatura nucleare utilizzando un istone fuso a una proteina fluorescente verde che si lega al DNA. Per confermare l’effetto del nocodazolo sulla divisione cellulare, le cellule sono state monitorate nel tempo e le immagini sono state acquisite usando Celloger® Mini Plus, un dispositivo per l’imaging in tempo reale di cellule vive. Il sistema è dotato di una fotocamera completamente motorizzata che consente di acquisire immagini in diverse posizioni a intervalli prestabiliti e programmati dall’utente. Ciò permette di monitorare i cambiamenti di ciascuna cellula in condizioni diverse.

Riferimenti

Mills, Christopher C., E. A. Kolb, e Valerie B. Sampson. "Sviluppo di terapie chemioterapiche con inibitori del ciclo cellulare per il trattamento del cancro negli adulti e nei bambini: terapie combinate contro il cancro." Cancer research 78.2 (2018): 320-325.
Otto, Tobias, e Piotr Sicinski. "Le proteine del ciclo cellulare come promettenti bersagli nella terapia del cancro." Nature Reviews Cancer 17.2 (2017): 93-115.
Blagosklonny, Mikhail V. "Il potenziale dell’ingegneria chemioterapica: arrestare il ciclo cellulare e sopprimere la senescenza per proteggersi dagli inibitori mitotici." Cell cycle 10.14 (2011): 2295-2298.4. Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one
Endo, Kingo, et al. "Il nocodazolo induce la morte mitotica delle cellule con caratteristiche simili all’apoptosi in Saccharomyces cerevisiae." FEBS letters 584.11 (2010): 2387-2392.
Anda, Teru, Kevin F. Sullivan, e Geoffrey M. Wahl. "La proteina di fusione istone-GFP consente un’analisi sensibile delle dinamiche cromosomiche nelle cellule di mammifero vive." Current Biology 8.7 (1998): 377-385.

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