NOTA APPLICATIVA: Analisi della citotossicità indotta dal nocodazolo utilizzando Celloger® Mini Plus
Introduzione
La citotossicità indica il grado di danno alle cellule causato da sostanze chimiche o fattori fisici. Misurarla mediante un test di citotossicità è essenziale per lo sviluppo di farmaci e la ricerca biologica. Le cellule seguono complesse vie di segnalazione che causano diversi processi di morte cellulare, come apoptosi, necrosi e necroptosi. Tuttavia, la maggior parte dei test di citotossicità viene misurata al termine dell'esperimento, rendendo difficile studiare la risposta dinamica delle cellule ai farmaci.
In questa nota applicativa, abbiamo voluto esaminare le prestazioni di un test di citotossicità mediante imaging in tempo reale. Le cellule trattate con diverse concentrazioni di Nocodazolo, il farmaco antitumorale, sono state colorate con un colorante fluorescente durante la morte cellulare e poi monitorate con Celloger® Mini Plus. L'imaging time-lapse ha mostrato che l'apoptosi aumentava in modo dose-dipendente in risposta al Nocodazolo; il grado di apoptosi è stato misurato quantitativamente e rappresentato graficamente con il software Analysis fornito con Celloger® Mini Plus.
Metodo
Le cellule HeLa sono state contate con Facscope B, un contacellule automatico, e seminate a 1 x 104 cellule/pozzetto in una piastra a 48 pozzetti. Dopo una notte di coltura, le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di Nocodazolo (16.625 nM, 31.25 nM, 62.5 nM, 125 nM, 250 nM). A questo punto, è stato aggiunto al campione il colorante CellTox green (Promega, G8742), che si lega al DNA delle cellule con l'integrità della membrana compromessa durante la morte cellulare. Utilizzando Celloger® Mini Plus, installato all'interno di un incubatore, sono state acquisite immagini delle cellule ogni ora per 48 ore, quindi le immagini sono state analizzate con il software Analysis. Il tasso di morte cellulare (%) è stato calcolato come copertura di fluorescenza (= cellule morte) ÷ confluenza in campo chiaro (= cellule totali).
Risultati
In seguito al trattamento delle cellule con diverse concentrazioni di nocodazolo e alla loro acquisizione nel tempo, la morfologia cellulare è cambiata in modo dose-dipendente e l'imaging in campo chiaro ha mostrato una riduzione della confluenza (Figura 1A, B). Inoltre, l'imaging in fluorescenza delle cellule morte colorate con CellTox, misurandone la copertura e quantificando la morte cellulare, ha mostrato che la percentuale di cellule fluorescenti aumenta con l'apoptosi (Figura 1C).
Figura 1. Analisi della morte cellulare dose-dipendente indotta dal Nocodazolo mediante imaging time-lapse
(A) Immagini combinate in campo chiaro e in fluorescenza per ciascuna concentrazione di Nocodazolo.
Le immagini sono mostrate a intervalli di 24 ore e la fluorescenza verde indica le cellule morte. (Barra di scala: 200 um)
(B) Grafico della confluenza (%) delle cellule totali nel tempo.
(C) Grafico del tasso di morte cellulare (%) nel tempo.
Conclusione
Celloger® Mini Plus è un dispositivo di imaging di cellule vive che consente di acquisire simultaneamente immagini in campo chiaro e in fluorescenza all'interno di un incubatore. Il sistema è dotato di una fotocamera completamente motorizzata che consente di acquisire immagini in diverse posizioni a intervalli prestabiliti dall'utente. Il grafico della confluenza nel tempo può essere ottenuto calcolando la confluenza delle immagini acquisite con il software Analysis. Inoltre, misurando la copertura di fluorescenza, è possibile quantificare il grado di apoptosi in funzione della concentrazione di Nocodazolo.
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