NOTA APPLICATIVA: Uso di Celloger® Mini Plus per osservare i cambiamenti morfologici e l’attività fagocitica in una linea cellulare di macrofagi

Sistema automatizzato di imaging di cellule vive Celloger® Mini Plus

Sistema integrato di monitoraggio delle cellule vive per l’acquisizione stabile di immagini di cellule in sospensione nella ricerca immunologica

Poiché i globuli bianchi, responsabili della funzione immunitaria, sono cellule in sospensione che circolano nei vasi sanguigni, gli studi immunologici utilizzano spesso varie linee cellulari in sospensione derivate dai globuli bianchi. A differenza delle cellule aderenti, quando si lavora con cellule in sospensione, il minimo movimento della piastra mentre la si posiziona sul microscopio fa fluttuare le cellule. Oltre ai problemi causati dall’instabilità della temperatura e della CO₂, di fatto non è possibile utilizzare un microscopio tradizionale per monitorare le cellule in tempo reale. Pertanto, per monitorare stabilmente le cellule in sospensione, è essenziale un dispositivo di imaging di cellule vive come Celloger® Mini Plus, che funziona all’interno di un incubatore¹. Inoltre, con Celloger® Mini Plus la fotocamera all’interno del sistema si sposta per acquisire immagini delle cellule in più posizioni, mantenendo il campione cellulare fermo, anziché utilizzare un tavolino mobile con la piastra sopra. Quando le cellule in sospensione sono state monitorate sia con Celloger® Mini Plus sia con un microscopio, le immagini acquisite con Celloger® Mini Plus sono risultate più stabili rispetto a quelle ottenute con il microscopio, in cui diverse cellule erano fuori fuoco (Figura 1).

Figura 1. (Destra) Vantaggi dell’utilizzo di Celloger® Mini Plus durante l’imaging di cellule in sospensione.

Quando si acquisiscono immagini di cellule in sospensione con un microscopio invertito, le fluttuazioni cellulari sono inevitabili, poiché il campione deve essere estratto dall’incubatore, collocato sul tavolino del microscopio e spostato per individuare altre posizioni nella piastra. Durante questo processo, si osserva che molte cellule si staccano dal fondo e risultano fuori fuoco (immagine a sinistra). Al contrario, Celloger® Mini Plus consente di svolgere l’intero processo di acquisizione delle immagini all’interno di un incubatore. La piastra è fissata stabilmente nel dispositivo e, spostando la fotocamera all’interno del sistema, è possibile acquisire immagini di più posizioni della piastra; così nulla provoca il distacco delle cellule e nessuna cellula risulta fuori fuoco (immagine a destra).

I globuli bianchi, parte del sistema immunitario, combattono le infezioni e difendono l’organismo da sostanze estranee. Un primo sistema di difesa, noto come immunità innata, genera rapide risposte infiammatorie per impedire immediatamente la diffusione e la propagazione di agenti patogeni estranei nell’organismo. Poiché l’attivazione del sistema immunitario innato inizia nell’arco di poche ore e genera rapide risposte infiammatorie, è importante monitorare in tempo reale le diverse difese cellulari che si verificano durante questo processo. Una funzione importante dell’immunità innata è il rapido reclutamento delle cellule immunitarie nell’area infetta. Tra i globuli bianchi, i monociti penetrano nei tessuti e si differenziano in macrofagi, inducendo una risposta immunitaria contro gli agenti patogeni invasori attraverso la fagocitosi. Abbiamo eseguito l’imaging di cellule vive con Celloger® Mini Plus (campo chiaro e canali a fluorescenza verde, obiettivo 10X) utilizzando la linea cellulare Raw264.7, che presenta le caratteristiche funzionali dei macrofagi ed è nota per i cambiamenti indotti dal lipopolisaccaride (LPS)².

Quando le cellule Raw264.7 sono state stimolate con LPS, il numero di cellule differenziate è aumentato. Le cellule, inizialmente rotonde e spesse, di forma cuboidale e debolmente aderenti, durante la differenziazione si sono allargate lentamente e hanno aderito più saldamente, assumendo una forma fusata. Questo processo è stato osservato tramite immagini acquisite ogni 15 minuti con Celloger® Mini Plus (ottica 10X).

Secondo lo studio di Saxena et al. (2003), le cellule Raw264.7 stimolate con LPS si differenziano in cellule simil-dendritiche³. Attraverso il monitoraggio in tempo reale con EVOM™AutoLCI abbiamo confermato che le cellule aderivano più saldamente e diventavano più larghe e appiattite rispetto alle cellule non trattate con LPS (Figura 2).

Figura 2. Monitoraggio dei cambiamenti morfologici nelle cellule Raw264.7 trattate con LPS

Questo cambiamento morfologico era più evidente 11 ore dopo il trattamento con LPS ed è durato fino a 22 ore. Inoltre, la stimolazione con LPS ha determinato la proliferazione cellulare, quantificata mediante la funzione di analisi della confluenza di Celloger® Mini Plus (Figura 3).

Figura 3. Curva di crescita delle cellule stimolate con LPS ottenuta tramite analisi della confluenza

Utilizzando le immagini time-lapse (acquisite con Celloger® Mini Plus, ottica 10X) e analizzando la confluenza cellulare con l’app di analisi AutoLCI, è possibile ottenere un grafico della crescita cellulare.

È stato riportato che l’attivazione dei macrofagi indotta da LPS aumenta la fagocitosi attraverso una via dipendente dal recettore toll-like 4^2,4. Per verificarlo in tempo reale, abbiamo acquisito immagini a fluorescenza utilizzando microsfere di lattice fluorescenti fagocitate dai macrofagi. Le microsfere fluorescenti da 2um oscillavano facilmente al minimo movimento e galleggiavano sopra la piastra. Questo non solo riduce l’efficienza di captazione delle microsfere da parte delle cellule, ma può anche rendere difficile l’acquisizione delle immagini. Infatti, persino i kit per saggi di fagocitosi disponibili in commercio consigliano di contare solo le cellule che hanno inglobato le microsfere mediante microscopia a fluorescenza o citometria a flusso, dopo aver lavato accuratamente il campione al termine dell’esperimento per rimuovere le microsfere non inglobate^5,6. In questo esperimento, l’imaging in tempo reale con Celloger® Mini Plus ha mostrato l’intero processo di fagocitosi delle microsfere da parte delle cellule e ha rivelato che l’inglobamento avveniva solo nelle cellule attivate, appiattite e allargate in seguito alla stimolazione con LPS (Figura 4A).

Figura 4. Fagocitosi da parte di cellule Raw264.7 stimolate con LPS, osservata con Celloger® Mini Plus (campo chiaro e canale a fluorescenza verde, ottica 10X)

Si ritiene che il comportamento di queste cellule attivate sia possibile perché, assumendo una forma fusata che favorisce la migrazione direzionale, si spostano efficacemente verso le microsfere, a differenza della forma rotonda e cuboidale che presentano prima della differenziazione. È stato inoltre osservato in tempo reale che, dopo l’inglobamento delle microsfere, queste venivano ripartite tra le cellule figlie insieme al citoplasma durante la divisione cellulare (Figura 4B).

È stato osservato che le cellule Raw264.7 attivate dopo la stimolazione con LPS inglobavano le microsfere fluorescenti. Sono state acquisite immagini time-lapse a intervalli di 15 minuti per osservare la migrazione delle cellule verso le microsfere e il loro inglobamento.
Durante la mitosi, le microsfere inglobate nelle cellule vengono ripartite tra le cellule figlie insieme al citoplasma.

Inoltre, è possibile ottenere informazioni sui processi dinamici che si verificano in diversi ambienti molecolari sfruttando le caratteristiche specifiche delle sonde fluorescenti. Se si acquisiscono immagini di un colorante fluorescente insieme alle immagini in campo chiaro, è possibile condurre studi più approfonditi. Utilizzando un colorante per acidi nucleici incapace di permeare le cellule, è possibile valutare la citotossicità rilevando l’aumento della permeabilità del colorante dovuto al danno della membrana durante l’apoptosi⁷. Inoltre, in particolare nei neutrofili, è possibile rilevare anche la formazione di NET mediante colorazione degli acidi nucleici⁸. È inoltre possibile quantificare la produzione di specie reattive dell’ossigeno⁹ nelle cellule utilizzando coloranti che reagiscono con queste specie, oppure osservare l’acidificazione intracellulare durante l’endocitosi e la fagocitosi mediante un colorante sensibile al pH¹⁰.

L’imaging di cellule vive con Celloger® Mini Plus consente di acquisire immagini ad alta risoluzione delle cellule, eliminando al contempo le perturbazioni fisiche, come i danni cellulari o le vibrazioni. È un sistema automatizzato che funziona perfettamente all’interno di un incubatore, eliminando la necessità di spostare il dispositivo dentro e fuori dall’incubatore. A differenza di altri dispositivi, Celloger® Mini Plus non dispone di un tavolino mobile: è invece la fotocamera all’interno del sistema a spostarsi per acquisire immagini delle cellule in più posizioni. Poiché il recipiente e i campioni cellulari restano fermi, si crea un ambiente stabile per la crescita delle cellule e aumenta la percentuale di successo della ricerca basata sulle cellule. Il sistema è compatibile con diversi tipi di recipienti di coltura e garantisce un’elevata riproducibilità del posizionamento per prestazioni di scansione stabili durante l’acquisizione di immagini multipunto; Celloger® Mini Plus consentirà pertanto di ottenere risultati affidabili nella ricerca immunologica.

Riferimenti

Awasthi, Bhuwan Prasad, et al. (2021) Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry
Wu, Tsu-Tuan et al. (2009) Toxicology letters vol.
Saxena, Rajiv K et al. (2003) Journal of biosciences vol.
Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one
Ariganello, Marianne B., et al. (2018) International journal of nanomedicine
Manda-Handzlik, Aneta, et al. (2018) Immunology and Cell Biology
Riss, Terry, et al. (2019) Manuale di orientamento per i saggi [internet]
Takishita, Yutaka, et al. (2019) Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition
Pal, Kunal, et al. (2019) Materials Science and Engineering: C
Diwu, Zhenjun, et al. (1999) Chemistry & biology