Rilevamento del Ca2+ nel tessuto muscolare mediante spettroscopia di fluorescenza
Negli ultimi anni, l’uso di sonde fluorescenti nella fisiologia cellulare è emerso come strumento indispensabile per l’analisi del funzionamento cellulare. I principi fisici alla base della fluorescenza sono illustrati dal diagramma degli stati elettronici (il cosiddetto diagramma di Jablonski, vedi Fig. 1), che mostra il processo in tre fasi che genera il segnale fluorescente (eccitazione - durata dello stato eccitato - emissione di fluorescenza) in un fluoroforo/indicatore, descritto in modo semplificato di seguito.
Fig. 1– Diagramma di Jablonski che illustra i processi della fluorescenza: un fluoroforo assorbe fotoni di energia più elevata e successivamente ne emette di energia inferiore, dando luogo alla fluorescenza durante la durata della fluorescenza.
La fluorescenza si ottiene quando un fotone di eccitazione (hνEX) proveniente da una sorgente esterna, come un LED ad alta potenza, viene assorbito da un fluoroforo, portandolo a un livello energetico più elevato (S1’). Durante la durata della fluorescenza, l’energia elevata (S1’) decade a uno stato energetico inferiore, S1. La fluorescenza si manifesta quindi con l’emissione di un fotone a energia inferiore (hνEM) e, pertanto, a lunghezza d’onda maggiore. Un concetto fondamentale in spettroscopia è la differenza di energia o di lunghezza d’onda, rappresentata da (hνEX-hνEM), chiamata spostamento di Stokes. Lo spostamento di Stokes consente di distinguere efficacemente l’eccitazione, rendendo la fluorescenza una tecnica molto sensibile, rilevabile su un fondo a bassa intensità e separata dai fotoni di eccitazione.
Fig. 2– Tipico diagramma di eccitazione-emissione, che mostra lo spettro di assorbimento di una molecola a lunghezza d’onda minore (cioè a energia maggiore) rispetto a una corrispondente sorgente di eccitazione e il conseguente spettro di fluorescenza della luce emessa a lunghezza d’onda maggiore (cioè a stato energetico inferiore).
Per realizzare un sistema di rilevamento si possono quindi individuare quattro elementi essenziali della segnalazione fluorescente:
- Sorgente luminosa di eccitazione adeguata alla banda di assorbimento del fluoroforo (ad es. LED ad alta potenza di lunghezza d’onda specifica)
- Un fluoroforo/indicatore (ad es. Fura-8 per rilevare il Ca2+ libero nel tessuto muscolare)
- Filtri per la lunghezza d’onda di emissione, per limitare la banda dei fotoni emessi o le bande sovrapposte
- Un sistema di rilevamento che registra la luce fluorescente e produce un’uscita registrabile sotto forma di segnale elettrico (ad es. tubi fotomoltiplicatori).
A prescindere dall’applicazione, la compatibilità di questi quattro elementi è essenziale per ottimizzare il rilevamento della fluorescenza.
Esempio di rilevamento del Ca2+ libero nel tessuto muscolare
In genere, si introduce un colorante fluorescente nel tessuto o in singole cellule per ottenere una risposta fluorescente dalla molecola marcata. Un esempio tipico è il rilevamento del transitorio aumento della concentrazione di calcio libero nel citoplasma/mioplasma (Δ[Ca2+]), un evento intermedio di segnalazione nell’accoppiamento eccitazione-contrazione. La quantificazione di Δ[Ca2+] viene eseguita usando luce monocromatica per eccitare la molecola di Ca2+ marcata con il colorante in un campione di tessuto/cellule, in una vasca per tessuti o in un allestimento sperimentale microscopico. Il segnale di fluorescenza emesso dal colorante indicatore può quindi essere usato per monitorare l’ampiezza e il decorso temporale di Δ[Ca2+], rilevati da sensori sensibili come tubi fotomoltiplicatori ad alta sensibilità (modulo PMT) o telecamere.
Il colorante indicatore raziometrico Fura-8™ è particolarmente adatto a rilevare i transitori di Δ[Ca2+]. Fura-8™ viene eccitato a lunghezze d’onda di 365 nm e 410 nm e l’emissione viene registrata a 525 nm in modalità a doppia eccitazione e singola emissione, ovvero con misurazione raziometrica. I vantaggi di questa tecnica di misurazione raziometrica sono:
- Riduzione al minimo degli artefatti da movimento
- Compensazione dei possibili effetti di un caricamento non uniforme
- Distribuzione eterogenea dell’indicatore fluorescente nelle cellule
- Sbiancamento del colorante indicatore nel rilevamento dei transitori di Δ[Ca2+] nel tessuto muscolare.
Ciò ha consentito di quantificare e confrontare:
- Tecniche ad alta risoluzione spaziale rispetto a tecniche ad alta risoluzione temporale su sezioni del ventricolo sinistro umano
- La possibilità di misurare i transitori della concentrazione di calcio libero (Δ[Ca2+]) in una vasca orizzontale per tessuti, usando sezioni del ventricolo sinistro umano o sezioni murine.
Fig. 3– Rappresentazione qualitativa di alcuni risultati del rilevamento del Ca2+ libero in sezioni di cuore umano usando il sistema SI-BF-100.
Intensità medie della fluorescenza delle sezioni del ventricolo sinistro umano caricate con Fura-8, rilevate a 525 nm dopo eccitazione rispettivamente a 340 nm e 410 nm, e rapporti calcolati (traccia inferiore) dai dati di imaging di una fotocamera Rolera EM-C2 (a sinistra). A destra, la risposta rilevata dal sistema SI-BF-100 usando due impostazioni di apertura e i rapporti calcolati (tracce inferiori). Sono inoltre mostrati i dati di fluorescenza raccolti con l’impostazione di apertura più piccola e filtrati passa-basso a 50 Hz. Si noti la grande differenza temporale nel rilevamento del segnale di fluorescenza tra i dati di imaging (Rolera EM-C2) e il rilevamento con SI-BF-100 (intervallo di 210 ms contro 1 ms), che consente di rilevare transitori di Ca2+ a variazione rapida (da Belz et al., SPIE Letters, 2016).
Riferimenti
Belz M., et. al. Fluorometro a fibra ottica per la ricerca fisiologica su sezioni muscolari. Proc. SPIE 9702, Optical Fibers and Sensors for Medical Diagnostics and Treatment Applications XVI, 2016.
Spettrofotometria. Wikipedia, l’enciclopedia libera, 2017 (riferimenti incrociati).
