NOTE D'APPLICATION : Observation de la mitose avec Celloger® Mini Plus

Introduction

Dans le processus du « cycle cellulaire », les cellules croissent et se divisent en deux cellules filles génétiquement identiques. Ce processus est régulé par une voie de signalisation complexe qui maintient l’homéostasie cellulaire en contrôlant la division cellulaire et la duplication de l’ADN¹. D’autre part, comme les cellules cancéreuses croissent et se divisent indéfiniment hors du contrôle du cycle cellulaire, des médicaments anti-mitotiques sont utilisés pour supprimer la prolifération anormale des cellules cancéreuses². En particulier, le nocodazole est reconnu comme un médicament anti-mitotique représentatif pour le traitement du cancer, et il a la caractéristique de perturber la dynamique des microtubules pendant la division cytoplasmique et nucléaire^3,4.

Dans cette étude, nous avons examiné l’activité anti-mitotique du nocodazole sur une lignée cellulaire cancéreuse en surveillant le processus de division cellulaire. À cette fin, des cellules HeLa ont été transfectées de manière stable avec une protéine fluorescente verte fusionnée à l’histone 2B (H2B-GFP), ce qui permet de visualiser la dynamique de la structure chromosomique pendant la progression du cycle cellulaire⁵. Ensuite, la division cellulaire a été suivie en temps réel après traitement des cellules avec ou sans nocodazole à l’aide du Celloger® Mini Plus, un dispositif d’imagerie cellulaire en direct.

Méthode

Des cellules HeLa transfectées avec le plasmide H2B-GFP ont été ensemencées dans une plaque à 24 puits à raison de 4 x 10⁴ cellules par puits. Les cellules ont été cultivées avec 10 % de sérum de veau fœtal et du milieu Eagle modifié de Dulbecco auquel 300 µg/mL de G418 a été ajouté. Après une culture d’une nuit pour permettre l’adhésion des cellules, elles ont été incubées avec ou sans 62,5 nM de nocodazole, et une imagerie en temps réel a été réalisée à l’aide du Celloger® Mini Plus (champ clair et canal de fluorescence verte, optique 10X). Des images ont été prises toutes les 15 minutes pendant 24 heures.

Résultats

Une imagerie en champ clair et en fluorescence en mode time-lapse des cellules HeLa transfectées avec la protéine fluorescente verte fusionnée à H2B a été réalisée pour observer les changements nucléaires lors de la mitose. Sur l’image en champ clair, la membrane nucléaire était clairement visible au début, puis elle a progressivement disparu et la métaphase, où les chromosomes sont alignés au centre de la cellule, a été observée à la fois sur les images en champ clair et en fluorescence (Figure 1A). À ce stade, les chromosomes étaient condensés et la fluorescence devenait plus intense par rapport à l’étape précédente. Les chromosomes entrés dans la phase suivante se sont séparés en deux chromatides sœurs, chacune se déplaçant vers des pôles opposés de la cellule. Comme montré sur la dernière image, deux cellules filles ont finalement été générées en télophase. En revanche, dans les cellules traitées avec le nocodazole, le processus de division cellulaire ne s’est pas poursuivi car les chromatides n’ont pas pu être divisées vers les deux extrémités. Sur l’image en champ clair, les cellules ont cessé d’adhérer au fond, et il a été confirmé que l’ADN a finalement été fragmenté, ce qui a conduit à l’apoptose sur l’image en fluorescence (Figure 1B).

Figure 1. Images en time-lapse des cellules HeLa transfectées avec H2B-GFP avec ou sans nocodazole.

Conclusion

Le marquage fluorescent est un outil utile pour observer la dynamique des organites dans les cellules vivantes. Jusqu’à présent, des plasmides ont été développés pour observer divers organites ou protéines cibles en utilisant des protéines de fusion fluorescentes, et de nombreuses études ont été menées pour vérifier les changements dans les organites ou la translocation des protéines induits par diverses stimulations.

Dans cette note d’application, nous avons réalisé une méthode de marquage nucléaire utilisant l’histone et une protéine de fusion fluorescente verte qui se lie à l’ADN. Pour confirmer l’effet du nocodazole sur la division cellulaire, les cellules ont été suivies dans le temps et des images ont été acquises à l’aide du Celloger® Mini Plus, un dispositif d’imagerie cellulaire en temps réel. Le système dispose d’une caméra entièrement motorisée qui permet l’imagerie de différentes positions à un intervalle défini par l’utilisateur. Cela permet de suivre les changements dans chaque cellule sous différentes conditions.

Références

Mills, Christopher C., E. A. Kolb, et Valerie B. Sampson. « Development of Chemotherapy with Cell-Cycle Inhibitors for Adult and Pediatric Cancer Therapy Combination Therapies for Cancer. » Cancer research 78.2 (2018) : 320-325.
Otto, Tobias, et Piotr Sicinski. « Cell cycle proteins as promising targets in cancer therapy. » Nature Reviews Cancer 17.2 (2017) : 93-115.
Blagosklonny, Mikhail V. « The power of chemotherapeutic engineering: arresting cell cycle and suppressing senescence to protect from mitotic inhibitors. » Cell cycle 10.14 (2011) : 2295-2298.4. Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one
Endo, Kingo, et al. « Nocodazole induces mitotic cell death with apoptotic-like features in Saccharomyces cerevisiae. » FEBS letters 584.11 (2010) : 2387-2392.
Anda, Teru, Kevin F. Sullivan, et Geoffrey M. Wahl. « Histone–GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. » Current Biology 8.7 (1998) : 377-385.

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