NOTE D'APPLICATION : Analyse de la cytotoxicité induite par le nocodazole à l'aide du Celloger® Mini Plus

Introduction

La cytotoxicité fait référence au degré de dommage causé aux cellules par des substances chimiques ou des facteurs physiques. La mesurer via un test de cytotoxicité est essentiel pour le développement de médicaments et la recherche biologique. Les cellules subissent des voies de signalisation complexes qui entraînent divers processus de mort cellulaire tels que l'apoptose, la nécrose et la nécroptose. Cependant, la plupart des tests de cytotoxicité sont réalisés en point final, ce qui rend difficile l'étude de la réponse dynamique des cellules aux médicaments.

Dans cette note d'application, nous avons cherché à examiner la performance d'un test de cytotoxicité utilisant l'imagerie en temps réel. Des cellules traitées avec différentes concentrations de Nocodazole, un médicament anticancéreux, ont été colorées avec un colorant fluorescent lors de la mort cellulaire, puis surveillées avec le Celloger® Mini Plus. Il a été observé par imagerie en time-lapse que l'apoptose augmentait de manière dépendante de la dose de Nocodazole, et le degré d'apoptose a été mesuré quantitativement et représenté graphiquement à l'aide du logiciel Analysis fourni avec le Celloger® Mini Plus.

Méthode

Les cellules HeLa ont été comptées à l'aide du Facscope B, un compteur automatique de cellules, puis ensemencées à 1 x 10⁴ cellules/puits dans une plaque de 48 puits. Après une culture d'une nuit, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations (16,625 nM, 31,25 nM, 62,5 nM, 125 nM, 250 nM) de Nocodazole. À ce stade, le colorant CellTox vert (Promega, G8742), qui se lie à l'ADN des cellules dont l'intégrité membranaire est altérée lors de la mort cellulaire, a été ajouté à l'échantillon. En utilisant le Celloger® Mini Plus installé dans un incubateur, des images cellulaires ont été acquises toutes les heures pendant 48 heures, puis analysées avec le logiciel Analysis. Le taux de mortalité cellulaire (%) a été calculé comme la couverture en fluorescence (= cellules mortes) ÷ la confluence en champ clair (= total des cellules).

Résultats

À la suite du traitement des cellules avec différentes concentrations de nocodazole et de leur imagerie au fil du temps, la morphologie des cellules a changé de manière dépendante de la concentration et une réduction de la confluence a été observée en imagerie en champ clair (Figure 1A, B). De plus, l'imagerie en fluorescence des cellules mortes colorées par le colorant CellTox, la mesure de leur couverture et la quantification de la mort cellulaire ont montré que la proportion de cellules fluorescentes augmente avec l'apoptose (Figure 1C).

Figure 1. Analyse de la mort cellulaire dépendante de la dose de Nocodazole par imagerie en time-lapse

(A) Images fusionnées en champ clair et fluorescence pour chaque concentration de Nocodazole.

Les images sont présentées à des intervalles de 24 heures, et la fluorescence verte indique les cellules mortes. (Barre d’échelle : 200 µm)

(B) Graphique de la confluence (%) des cellules totales au fil du temps.

(C) Graphique du taux de mort cellulaire (%) au fil du temps.

Conclusion

Le Celloger® Mini Plus est un dispositif d’imagerie cellulaire en temps réel capable d’effectuer simultanément des images en champ clair et en fluorescence dans un incubateur. Le système dispose d’une caméra entièrement motorisée qui permet d’imager différentes positions à un intervalle défini par l’utilisateur. Le graphique de confluence au fil du temps peut être obtenu en calculant la confluence des images capturées à l’aide du logiciel Analysis. De plus, en mesurant la couverture en fluorescence, le degré d’apoptose en fonction de la concentration de Nocodazole peut être quantifié.

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