NOTE D'APPLICATION : Utilisation du Celloger® Mini Plus pour Observer les Changements Morphologiques et l'Activité Phagocytaire dans une Lignée Cellulaire de Macrophages

Système automatisé d’imagerie cellulaire vivante Celloger® Mini Plus

Un système intégré de surveillance des cellules vivantes pour une imagerie stable des cellules en suspension en recherche immunologique

Comme les globules blancs responsables de la fonction immunitaire sont des cellules en suspension qui circulent dans les vaisseaux sanguins, les études en immunologie utilisent souvent diverses lignées cellulaires en suspension issues des globules blancs. Contrairement aux cellules adhérentes, les cellules en suspension flottent dès qu’une légère secousse se produit lors du positionnement de la plaque sur le microscope. En plus des problèmes liés à l’instabilité de la température et du CO₂, il est en fait impossible d’utiliser un microscope traditionnel pour surveiller les cellules en temps réel. Par conséquent, pour surveiller de manière stable les cellules en suspension, un dispositif d’imagerie cellulaire vivante tel que le Celloger® Mini Plus, qui fonctionne à l’intérieur d’un incubateur, est indispensable¹. De plus, avec le Celloger® Mini Plus, la caméra intégrée se déplace pour capturer les images des cellules à plusieurs positions, maintenant ainsi l’échantillon cellulaire dans un état stable, contrairement à un plateau mobile avec une plaque dessus. Lors de la surveillance des cellules en suspension à la fois avec le Celloger® Mini Plus et un microscope, l’imagerie avec le Celloger® Mini Plus s’est révélée plus stable, plusieurs cellules étant hors de mise au point avec le microscope (Figure 1).

Figure 1. (Droite) Avantages de l’utilisation du Celloger® Mini Plus pour l’imagerie des cellules en suspension.

Pour l’imagerie des cellules en suspension avec un microscope inversé, les fluctuations cellulaires sont inévitables car l’échantillon doit être retiré de l’incubateur, placé sur la platine du microscope, puis déplacé pour localiser d’autres positions dans la plaque. Dans ce processus, de nombreuses cellules flottent au-dessus du fond et sont hors de mise au point (image de gauche). En revanche, l’imagerie avec le Celloger® Mini Plus permet de réaliser l’ensemble du processus d’imagerie à l’intérieur de l’incubateur. La plaque est solidement fixée sur l’appareil et plusieurs positions dans la plaque peuvent être imagées en déplaçant la caméra intégrée ; ainsi, rien ne provoque la flottabilité des cellules et aucune cellule n’est hors de mise au point (image de droite).

Les globules blancs, en tant que partie du système immunitaire, combattent les infections et défendent l’organisme contre les substances étrangères. Un système de première ligne de défense appelé immunité innée génère des réponses inflammatoires rapides pour empêcher immédiatement la propagation et le déplacement des agents pathogènes étrangers dans tout le corps. Comme l’activation du système immunitaire inné débute en quelques heures et génère des réponses inflammatoires rapides, il est important de surveiller en temps réel les diverses défenses cellulaires qui se produisent dans ce processus. Une fonction importante de l’immunité innée est le recrutement rapide des cellules immunitaires vers une zone infectée. Parmi les globules blancs, les monocytes infiltrent les tissus et se différencient en macrophages, tout en induisant une réponse immunitaire contre les agents pathogènes envahisseurs par phagocytose. Nous avons réalisé une imagerie cellulaire vivante avec le Celloger® Mini Plus (canaux champ clair et fluorescence verte, objectif 10X) en utilisant la lignée cellulaire Raw264.7, qui représente les caractéristiques fonctionnelles des macrophages et est bien connue pour les changements induits par le lipopolysaccharide (LPS)².

Lorsque les cellules Raw264.7 ont été stimulées par le LPS, le nombre de cellules différenciées a augmenté. Les cellules rondes et cuboïdes épaisses en état d’adhérence lâche se sont différenciées, s’étalant lentement et adhérant plus fermement sous une forme fusiforme, ce qui a été observé grâce aux images prises toutes les 15 minutes par le Celloger® Mini Plus (optique 10X).

Selon l’étude de Saxena et al. (2003), les cellules Raw264.7 stimulées par le LPS se différencient en cellules dendritiques³. Nous avons confirmé par surveillance en temps réel avec EVOM™AutoLCI que les cellules adhéraient plus fermement et devenaient plus larges et plus plates que les cellules non traitées au LPS (Figure 2).

Figure 2. Surveillance des changements morphologiques des cellules Raw264.7 avec LPS

Ce changement morphologique était plus visible 11 heures après le traitement au LPS et a duré jusqu’à 22 heures. De plus, la stimulation par le LPS a entraîné une prolifération cellulaire, quantifiée grâce à la fonction d’analyse de confluence du Celloger® Mini Plus (Figure 3).

Figure 3. Courbe de croissance des cellules stimulées par LPS via l’analyse de confluence

En utilisant les images en time-lapse (capturées via Celloger® Mini Plus, optique 10X) et en analysant la confluence cellulaire avec l’application d’analyse AutoLCI, un graphique de croissance cellulaire peut être obtenu.

Il a été rapporté que l’activation des macrophages induite par le LPS augmente la phagocytose via la voie dépendante du récepteur toll-like 4^2,4. Pour confirmer cela en temps réel, nous avons réalisé une imagerie en fluorescence utilisant des billes fluorescentes en latex qui ont été ingérées par les macrophages. Les billes fluorescentes de 2 µm de taille oscillaient facilement au moindre mouvement et flottaient au-dessus de la plaque. Cela diminue non seulement l’efficacité de l’absorption des billes par les cellules, mais complique aussi l’imagerie. En fait, même les kits commerciaux d’essai de phagocytose recommandent de ne compter les cellules ayant ingéré les billes qu’après un lavage approprié en fin d’expérience pour éliminer les billes non ingérées, par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux^5,6. Dans cette expérience, l’imagerie en temps réel du Celloger® Mini Plus a montré l’ensemble du processus de phagocytose des billes par les cellules et l’ingestion des billes uniquement par les cellules activées, étalées et stimulées au LPS (Figure 4A).

Figure 4. Phagocytose des cellules Raw264.7 stimulées par LPS observée avec Celloger® Mini Plus (champ clair et canal fluorescence verte, optique 10X)

Le comportement de ces cellules activées est possible car elles se déplacent efficacement vers les billes sous une forme fusiforme, ce qui favorise une migration directionnelle comparée à la forme ronde et cubique avant différenciation. Il a également été observé en temps réel que les billes étaient réparties dans les cellules filles avec le cytoplasme lors de la division cellulaire après absorption des billes (Figure 4B).

Il a été observé que les cellules Raw264.7 activées après stimulation au LPS ingéraient les billes fluorescentes. Des images en time-lapse ont été prises toutes les 15 minutes pour observer la migration des cellules vers les billes et leur absorption.
Les billes ingérées à l’intérieur des cellules sont réparties dans les cellules filles avec le cytoplasme lors de la mitose.

De plus, il est possible d’obtenir des informations sur les processus dynamiques dans divers environnements moléculaires en utilisant les caractéristiques uniques des sondes fluorescentes. Si un colorant fluorescent peut être imagé en plus de l’imagerie en champ clair, cela permet des études plus approfondies. En utilisant un colorant d’acide nucléique non perméant aux cellules, la cytotoxicité peut être évaluée par l’augmentation de la perméabilité du colorant due aux dommages membranaires lors de l’apoptose⁷. Et dans le cas particulier des neutrophiles, la formation de NET peut également être détectée par coloration des acides nucléiques⁸. En outre, il est possible de quantifier la production d’espèces réactives de l’oxygène⁹ dans les cellules en utilisant des colorants réactifs ou d’observer l’acidification intracellulaire lors de l’endocytose et de la phagocytose avec un colorant sensible au pH¹⁰.

L’imagerie cellulaire vivante avec Celloger® Mini Plus permet d’obtenir des images haute résolution des cellules tout en éliminant les perturbations physiques telles que les dommages cellulaires ou les vibrations. C’est un système automatisé qui fonctionne parfaitement à l’intérieur d’un incubateur, supprimant le besoin de déplacer l’appareil à l’intérieur ou à l’extérieur de l’incubateur. Contrairement à d’autres dispositifs, le Celloger® Mini Plus ne possède pas de platine mobile ; c’est la caméra intégrée qui se déplace pour capturer les images des cellules à plusieurs positions. Comme le récipient et les échantillons cellulaires restent stables, cela offre un environnement stable pour la croissance cellulaire et augmente le taux de réussite des recherches basées sur les cellules. Divers types de récipients de culture sont compatibles avec le système, qui offre une grande reproductibilité de position pour une performance de balayage stable lors de l’imagerie multipoint ; ainsi, le Celloger® Mini Plus apportera des résultats fiables en recherche immunologique.

Références

Awasthi, Bhuwan Prasad, et al. (2021) Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry
Wu, Tsu-Tuan et al. (2009) Toxicology letters vol.
Saxena, Rajiv K et al. (2003) Journal of biosciences vol.
Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one
Ariganello, Marianne B., et al. (2018) International journal of nanomedicine
Manda-Handzlik, Aneta, et al. (2018) Immunology and Cell Biology
Riss, Terry, et al. (2019) Assay Guidance Manual [internet]
Takishita, Yutaka, et al. (2019) Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition
Pal, Kunal, et al. (2019) Materials Science and Engineering: C
Diwu, Zhenjun, et al. (1999) Chemistry & biology