アプリノート：Celloger® Mini Plusを用いた有糸分裂の観察

はじめに

「細胞周期」の過程では、細胞が成長し、遺伝的に同一の2つの娘細胞に分裂します。これは、細胞分裂とDNA複製を調節する複雑なシグナル伝達経路によって細胞の恒常性を維持しています¹。一方で、がん細胞は細胞周期の制御を超えて無制限に増殖・分裂するため、抗有糸分裂薬ががん細胞の異常増殖を抑制するために使用されます²。特に、ノコダゾールはがん治療の代表的な抗有糸分裂薬として知られており、細胞質および核分裂中の微小管動態を妨害する特性を持っています^3,4。

本研究では、がん細胞株に対するノコダゾールの抗有糸分裂活性を、細胞分裂過程のモニタリングにより検証しました。そのために、Hela細胞に緑色蛍光タンパク質と融合したヒストン2B（H2B-GFP）を安定的にトランスフェクトし、細胞周期進行中の染色体構造の動態を可視化しました⁵。その後、ノコダゾール処理の有無で細胞分裂をリアルタイムで観察するために、ライブセルイメージング装置であるCelloger® Mini Plusを使用しました。

方法

H2B-GFPプラスミドをトランスフェクトしたHeLa細胞を24ウェルプレートに4×10⁴細胞/ウェルの密度で播種しました。細胞は10％胎牛血清とDulbecco改変イーグル培地に300 μg/mLのG418を添加した培地で培養しました。細胞が付着するまで一晩培養した後、62.5 nMのノコダゾールの有無でインキュベートし、Celloger® Mini Plus（明視野および緑色蛍光チャネル、10倍光学）を用いてリアルタイムイメージングを行いました。画像は15分ごとに24時間撮影しました。

結果

H2B-GFPをトランスフェクトしたHela細胞の明視野および蛍光タイムラプスイメージングを行い、有糸分裂中の核の変化を観察しました。明視野画像では、開始時に核膜が明瞭に見え、その後徐々に消失し、染色体が細胞中央に整列する中期が明視野および蛍光画像の両方で観察されました（図1A）。この時点で染色体は凝縮し、蛍光は前段階よりも強くなりました。後期に入った染色体は2つの姉妹染色分体に分かれ、それぞれが細胞の反対極に移動しました。最後の画像に示されるように、終期で2つの娘細胞が最終的に生成されました。一方、ノコダゾール処理細胞では、染色分体が両端に分離できず、細胞分裂過程は進行しませんでした。明視野画像では細胞が底面に付着しなくなり続け、蛍光画像ではDNAが最終的に断片化し、アポトーシスが確認されました（図1B）。

図1. ノコダゾールの有無によるH2B-GFPトランスフェクトHela細胞のタイムラプス画像。

結論

蛍光標識は、生細胞内の細胞小器官の動態を観察するための有用なツールです。これまでに、蛍光融合タンパク質を用いて様々な細胞小器官や標的タンパク質を観察するためのプラスミドが開発され、様々な刺激によって誘導される細胞小器官の変化やタンパク質の局在変化を検証する多くの研究が行われています。

本アプリケーションノートでは、DNAに結合するヒストンと緑色蛍光融合タンパク質を用いた核標識法を実施しました。ノコダゾールの細胞分裂への影響を確認するために、細胞を時間経過でモニタリングし、リアルタイムライブセルイメージング装置であるCelloger® Mini Plusを用いて画像を取得しました。本システムは完全にモーター制御されたカメラを備えており、ユーザーが設定した間隔で様々な位置の撮影が可能です。これにより、異なる条件下での各細胞の変化を追跡することができます。

参考文献

Mills, Christopher C., E. A. Kolb, and Valerie B. Sampson. "Development of Chemotherapy with Cell-Cycle Inhibitors for Adult and Pediatric Cancer Therapy Combination Therapies for Cancer." Cancer research 78.2 (2018): 320-325.
Otto, Tobias, and Piotr Sicinski. "Cell cycle proteins as promising targets in cancer therapy." Nature Reviews Cancer 17.2 (2017): 93-115.
Blagosklonny, Mikhail V. "The power of chemotherapeutic engineering: arresting cell cycle and suppressing senescence to protect from mitotic inhibitors." Cell cycle 10.14 (2011): 2295-2298.4. Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one
Endo, Kingo, et al. "Nocodazole induces mitotic cell death with apoptotic-like features in Saccharomyces cerevisiae." FEBS letters 584.11 (2010): 2387-2392.
Anda, Teru, Kevin F. Sullivan, and Geoffrey M. Wahl. "Histone–GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells." Current Biology 8.7 (1998): 377-385.

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