アプリノート：Celloger® Mini Plusを用いたノコダゾール誘発細胞毒性の解析

はじめに

細胞毒性とは、化学物質や物理的要因によって細胞に与えられる損傷の程度を指します。細胞毒性アッセイによる測定は、医薬品開発や生物学的研究において不可欠です。細胞は複雑なシグナル伝達経路を経て、アポトーシス、ネクローシス、ネクロプトーシスなどのさまざまな細胞死プロセスを引き起こします。しかし、多くの細胞毒性アッセイはエンドポイントで測定されるため、薬剤に対する細胞の動的な応答を研究することが困難です。

本応用ノートでは、リアルタイムイメージングを用いた細胞毒性アッセイの性能を検証しました。抗がん剤であるノコダゾールをさまざまな濃度で処理した細胞を、細胞死時に蛍光色素で染色し、Celloger® Mini Plusでモニタリングしました。タイムラプスイメージングにより、ノコダゾールの濃度依存的にアポトーシスが増加することが観察され、Celloger® Mini Plusに付属のAnalysisソフトウェアを用いてアポトーシスの程度を定量的に測定しグラフ化しました。

方法

HeLa細胞を自動細胞計数装置Facscope Bで計数し、48ウェルプレートに1×10⁴細胞/ウェルで播種しました。一晩培養後、ノコダゾールを16.625 nM、31.25 nM、62.5 nM、125 nM、250 nMの各濃度で処理しました。この時点で、細胞死時に膜の完全性が損なわれた細胞のDNAに結合するCellToxグリーン染色液（Promega, G8742）をサンプルに添加しました。インキュベーター内に設置したCelloger® Mini Plusを用いて、1時間ごとに48時間にわたり細胞画像を取得し、Analysisソフトウェアで解析しました。細胞死率（％）は蛍光被覆率（＝死細胞）÷明視野コンフルエンシー（＝全細胞）で計算しました。

結果

異なる濃度のノコダゾールで処理した細胞を時間経過でイメージングした結果、細胞の形態は濃度依存的に変化し、明視野イメージングでコンフルエンシーの縮小が観察されました（図1A、B）。さらに、CellTox染色液で染色された死細胞の蛍光イメージングにより被覆率を測定し細胞死を定量化したところ、蛍光細胞の割合がアポトーシスの増加に伴い増加することが示されました（図1C）。

図1. タイムラプスイメージングによるノコダゾール濃度依存的細胞死の解析

(A) ノコダゾール各濃度の明視野と蛍光画像の合成画像。

画像は24時間ごとに示されており、緑色の蛍光は死細胞を示します。（スケールバー：200 μm）

(B) 時間経過に伴う全細胞のコンフルエンシー（％）グラフ。

(C) 時間経過に伴う細胞死率（％）グラフ。

結論

Celloger® Mini Plusは、インキュベーター内で明視野と蛍光イメージングを同時に行えるライブセルイメージング装置です。本システムは完全モーター制御のカメラを搭載しており、ユーザーが設定した間隔で複数の位置のイメージングが可能です。Analysisソフトウェアを用いて取得画像のコンフルエンシーを計算することで、時間経過に伴うコンフルエンシーグラフを取得できます。さらに、蛍光被覆率を測定することで、ノコダゾール濃度に応じたアポトーシスの程度を定量化できます。

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