アプリケーションノート：Celloger® Mini Plusを用いたマクロファージ細胞株の形態変化および貪食活性の観察

Celloger® Mini Plus 自動ライブセルイメージングシステム

免疫学研究における懸濁細胞の安定したイメージングのための統合ライブセルモニタリングシステム

免疫機能を担う白血球は血管内を移動する懸濁細胞であるため、免疫学研究では白血球由来のさまざまな懸濁細胞株がよく用いられます。懸濁細胞は接着細胞とは異なり、顕微鏡上でプレートを置く際のわずかな動きで細胞が浮遊してしまいます。温度やCO₂の不安定さによる問題に加え、従来の顕微鏡ではリアルタイムで細胞をモニターすることは実際には困難です。したがって、懸濁細胞を安定的にモニターするには、インキュベーター内で動作するCelloger® Mini Plusのようなライブセルイメージング装置が不可欠です¹。さらに、Celloger® Mini Plusでは、プレートを載せた可動ステージの代わりに、システム内のカメラが移動して複数の位置の細胞画像を撮影し、細胞サンプルを安定した状態に保ちます。懸濁細胞をCelloger® Mini Plusと顕微鏡の両方で観察したところ、Celloger® Mini Plusによるイメージングの方が安定しており、顕微鏡ではいくつかの細胞がピント外れとなっていました（図1）。

図1. 懸濁細胞イメージングにおけるCelloger® Mini Plus使用の利点（右）

倒立顕微鏡を用いた懸濁細胞のイメージングでは、サンプルをインキュベーターから取り出し、顕微鏡ステージに置き、プレート内の他の位置を探すために移動させる必要があるため、細胞の揺れは避けられません。この過程で多くの細胞が床から浮遊し、ピントが合わなくなります（左画像）。一方、Celloger® Mini Plusを用いたイメージングでは、インキュベーター内でイメージングの全工程が可能です。プレートは装置に安定して固定され、システム内のカメラを動かしてプレート内の複数の位置を撮影できるため、細胞の浮遊が起こらず、ピント外れの細胞も観察されません（右画像）。

免疫系の一部である白血球は感染と戦い、異物から体を守ります。自然免疫と呼ばれる第一防御ラインは、速やかな炎症反応を引き起こし、異物病原体の体内での拡散と移動を即座に防ぎます。自然免疫の活性化は数時間以内に始まり迅速な炎症反応を生じるため、この過程で起こるさまざまな細胞防御をリアルタイムでモニターすることが重要です。自然免疫の重要な機能の一つは、感染部位への免疫細胞の迅速な動員です。白血球の中で単球は組織に浸潤し、マクロファージに分化し、貪食を通じて侵入病原体に対する免疫応答を誘導します。マクロファージの機能的特徴を示し、リポ多糖（LPS）による変化でよく知られるRaw264.7細胞株を用いて、Celloger® Mini Plus（明視野および緑色蛍光チャネル、10倍対物レンズ）でライブセルイメージングを行いました²。

Raw264.7細胞にLPSを刺激すると、分化した細胞が増加しました。丸く厚みのある立方体状の細胞がゆるく接着した状態から、紡錘形にゆっくりと広がり、よりしっかりと接着する様子が、Celloger® Mini Plus（10倍光学系）で15分ごとに撮影した画像で観察されました。

Saxenaら（2003年）の研究によると、LPS刺激を受けたRaw264.7細胞は樹状細胞様に分化します³。EVOM™AutoLCIを用いたリアルタイムモニタリングにより、LPS処理なしの細胞に比べて、細胞がよりしっかり接着し、広く平らになったことを確認しました（図2）。

図2. LPS刺激によるRaw264.7細胞の形態変化のモニタリング

この形態変化はLPS処理後11時間でより顕著になり、22時間まで持続しました。また、LPS刺激は細胞増殖も引き起こし、Celloger® Mini Plusのコンフルエンシー解析機能で定量化されました（図3）。

図3. コンフルエンシー解析によるLPS刺激細胞の増殖曲線

Celloger® Mini Plus（10倍光学系）で撮影したタイムラプス画像とAutoLCI解析アプリによる細胞コンフルエンシー解析を用いて、細胞増殖グラフを得ることができます。

LPSによるマクロファージの活性化は、トール様受容体4依存経路を介して貪食能を増加させるとの報告があります^2,4。これをリアルタイムで確認するため、蛍光ラテックスビーズを用いた蛍光イメージングを行いました。2μmサイズの蛍光ビーズはわずかな動きでも揺れやすく、プレート上で浮遊します。これにより細胞のビーズ取り込み効率が低下し、イメージングも困難になります。実際、市販の貪食アッセイキットでは、非取り込みビーズを除去するために適切に洗浄した後、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーでビーズ取り込み細胞のみをカウントすることが推奨されています^5,6。本実験では、Celloger® Mini Plusのリアルタイムイメージングにより、細胞のビーズ貪食過程全体と、LPS刺激で平らに広がった活性化細胞のみがビーズを取り込む様子を観察できました（図4A）。

図4. Celloger® Mini PlusによるLPS刺激Raw264.7細胞の貪食観察（明視野および緑色蛍光チャネル、10倍光学系）

これらの活性化細胞の挙動は、分化前の丸く立方体状の形状に比べ、紡錘形で方向性のある移動を効率的に行いビーズに向かうため可能であると考えられます。また、ビーズ取り込み後の細胞分裂時に、ビーズが細胞質とともに娘細胞に分配される様子もリアルタイムで観察されました（図4B）。

LPS刺激後の活性化Raw264.7細胞が蛍光ビーズを取り込む様子を観察。15分間隔でタイムラプス撮影し、細胞がビーズに向かって移動し取り込む過程を追跡。
取り込まれたビーズは細胞内で有糸分裂時に細胞質とともに娘細胞に分配される。

さらに、蛍光プローブの特性を活用することで、さまざまな分子環境の動的過程情報を得ることが可能です。明視野イメージングと同時に蛍光色素を追加で撮影できれば、より詳細な研究に活用できます。細胞透過性のない核酸染色剤を用いれば、アポトーシス時の膜損傷による染色剤の透過性増加を通じて細胞毒性を評価できます⁷。特に好中球の場合は、核酸染色によりNET形成も検出可能です⁸。さらに、活性酸素種に反応する染料を用いて細胞内の活性酸素種生成を定量化したり、pH感受性色素を用いてエンドサイトーシスや貪食過程の細胞内酸性化を観察することも可能です^9,10。

Celloger® Mini Plusによるライブセルイメージングは、細胞損傷や揺れなどの物理的な撹乱を排除しつつ、高解像度の細胞画像を取得できます。インキュベーター内で完璧に機能する自動化システムであり、装置の出し入れが不要です。ほかの装置とは異なり、Celloger® Mini Plusは可動ステージを持たず、システム内のカメラが移動して複数位置の細胞画像を撮影します。容器と細胞サンプルが安定した状態にあるため、細胞の成長に安定した環境を提供し、細胞ベースの研究の成功率を高めます。さまざまな種類の培養容器に対応し、多点イメージング時の安定したスキャン性能のための高い位置再現性を持つため、Celloger® Mini Plusは免疫学研究において信頼できる結果をもたらします。

参考文献

Awasthi, Bhuwan Prasad, et al. (2021) Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry
Wu, Tsu-Tuan et al. (2009) Toxicology letters vol.
Saxena, Rajiv K et al. (2003) Journal of biosciences vol.
Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one
Ariganello, Marianne B., et al. (2018) International journal of nanomedicine
Manda-Handzlik, Aneta, et al. (2018) Immunology and Cell Biology
Riss, Terry, et al. (2019) Assay Guidance Manual [internet]
Takishita, Yutaka, et al. (2019) Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition
Pal, Kunal, et al. (2019) Materials Science and Engineering: C
Diwu, Zhenjun, et al. (1999) Chemistry & biology