Misurazioni TEER automatizzate

Le cellule epiteliali dell’intestino tenue (SMI) sono state prelevate da donatori post mortem previa approvazione dell’IRB. Le cellule SMI sono state seminate in piastre per colture cellulari a 96 pozzetti con membrana PET PermaCell™ ad alta densità di pori (0.4µm, 1.0x108 pori/cm2) (MatTek Life Sciences; Ashland, MA), portate all’interfaccia aria-liquido (ALI) e coltivate per 2 settimane in un terreno di coltura appositamente formulato per indurre la differenziazione. Nella Fig. 1A-D sono mostrati un’immagine del sistema PermaCell™ a 96 pozzetti e una sezione trasversale rappresentativa del modello tissutale EpiIntestinal™ colorata con H&E.

Fig. 1–Misurazione della TEER nel tessuto EpiIntestinal coltivato in una piastra PermaCell ad alta processività a 96 pozzetti. A) Coperchio della piastra. B) Piastra degli inserti con fondo a membrana da 0.4 µm. C) Piastra serbatoio. D) Sezione trasversale colorata con H&E del tessuto EpiIntestinal™ coltivato nella piastra degli inserti a 96 pozzetti. E) Sezione trasversale delle piastre degli inserti e di fondo riempite con 100mM KCl, che mostra gli elettrodi TEER.

Prima delle misurazioni del TEER, i tessuti EpiIntestinal™ sono stati trasferiti in KCl sterile 100 mM (150 µL apicali, 400 µL basolaterali). Il TEER è stato misurato sia manualmente, utilizzando un elettrodo STX HTS EVOM™ insieme a un EVOM™ Manual, sia automaticamente, utilizzando il sistema automatizzato di misurazione del TEER EVOM™ Auto (World Precision Instruments, LLC, Sarasota, Florida). In Fig. 1E è illustrato uno schema del sistema Permacell™ a 96 pozzetti, con la posizione degli elettrodi EVOM™ Auto 96 HTS. In Fig. 2A-B è mostrato un confronto tra l’EVOM™ Manual con l’elettrodo STX HTS EVOM™ e i sistemi EVOM™ Auto. Le letture automatizzate sono state eseguite con un tempo di lettura di 2 secondi per pozzetto. Prima del calcolo del TEER, le misurazioni della resistenza dei campioni di tessuto sono state corrette sottraendo i valori di resistenza del tampone KCl 100mM in bianco nella piastra ricevente dell’assemblaggio a 96 transwell.

Fig. 2–L’EVOM™ Auto consente misurazioni del TEER ad alta processività. A) L’EVOM™ Manual con elettrodo STX HTS in una piastra Transwell a 96 pozzetti impiega 24 minuti e 3 secondi per misurare 96 campioni. B) Il sistema EVOM™ Auto per la misurazione automatizzata del TEER in una piastra a 96 pozzetti richiede solo 4 minuti e 10 secondi per leggere 96 campioni.

Prima dell’esposizione agli articoli di prova, sono state effettuate misurazioni basali della funzione di barriera del tessuto (TEER) secondo i metodi descritti sopra. L’esposizione a breve termine (tre ore) all’acido etilendiamminotetraacetico (EGTA) è stata condotta utilizzando come veicolo una soluzione salina bilanciata di Hank 1X (HBSS) contenente 10 mM di HEPES, applicata alla superficie apicale. L’esposizione a lungo termine (6 giorni) al sale sodico del destrano solfato (DSS) è stata condotta aggiungendo DSS al terreno di coltura in entrambi i compartimenti, apicale e basolaterale. Il danno tissutale reversibile, valutato mediante TEER, è espresso rispetto ai rispettivi tessuti di controllo trattati con il veicolo.

I campioni di tessuto sono stati fissati per 3 ore in formalina al 10%, permeabilizzati per 30 minuti con soluzione salina tamponata con Tris (TBS) 1X contenente Triton-X-100 allo 0,1% e bloccati per 2 ore in TBS 1X contenente siero normale di capra al 10%. L’anticorpo monoclonale ricombinante di coniglio anti-Claudin 1 (Abcam cat# ab211737, Cambridge, MA) è stato diluito 1:1.000 in TBS e incubato a temperatura ambiente per 2 ore con agitazione delicata. L’anticorpo secondario di capra anti-IgG di coniglio (H+L), Alexa Fluor™ 555 (ThermoFisher cat# A21429, Waltham, MA), è stato diluito 1:400 in TBS e incubato a temperatura ambiente per 1 ora con agitazione delicata. I nuclei sono stati controcolorati con 4’,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale Olympus FV1000 usando sia un obiettivo 2X sia un obiettivo a immersione in olio 40X. Le immagini rappresentative della colorazione immunoistochimica sono mostrate nella Fig. 3D e nella Fig. 4D, rispettivamente per le esposizioni a EGTA e DSS.

Fig. 3–Il modello tissutale EpiIntestinal™ dimostra un recupero completo dopo un’esposizione di 30 ore a EGTA e un’incubazione di 48 ore dopo l’esposizione. A) Misurazioni TEER. B) Permeabilità alla Lucifer Yellow (LY). C) Coefficiente di permeabilità apparente per LY. Equazione per il calcolo:, dove ΔQ/Δt è la concentrazione di LY presente nel compartimento basolaterale al tempo trascorso, Vr è il volume del tampone ricevente nel compartimento basolaterale, A è la superficie del tessuto e C è la concentrazione iniziale di LY applicata alla superficie apicale del tessuto. D) Colorazione immunologica della proteina di barriera Claudin 1 (rosso), controcolorata con DAPI (ciano). Barre di errore = deviazione standard.Fig. 4 – Effetti sul modello tissutale EpiIntestinal dopo un’esposizione di 6 giorni al sale sodico del destrano solfato (DSS) e un’incubazione di 6 giorni dopo l’esposizione. A) Misurazioni TEER. B) Permeabilità alla Lucifer Yellow (LY). C) Coefficiente di permeabilità apparente per LY. Equazione per il calcolo: P app= ∆Q/∆t x Vr/(A*C) , dove ∆Q/∆t è la concentrazione di LY presente nel compartimento basolaterale al tempo trascorso, Vr è il volume del tampone ricevente nel compartimento basolaterale, A è la superficie del tessuto e C è la concentrazione iniziale di LY applicata alla superficie apicale del tessuto. D) Colorazione immunologica della proteina di barriera Claudin 1 (rosso), controcolorata con DAPI (ciano). Barre di errore = deviazione standard.

I tessuti sono stati trasferiti in 250µL di HBSS 1X contenente 10mM di HEPES e 1.98g/L di glucosio, e sulla superficie apicale sono stati applicati 50µL di colorante LY 100µM nello stesso tampone. La soluzione ricevente basolaterale (RS) è stata sostituita ogni 30 minuti per 2 ore. Sono stati utilizzati 100µL di ciascun campione di RS per determinare la concentrazione di LY nella RS a ogni intervallo di tempo. I campioni di RS sono stati letti con un lettore di piastre Spectramax M2 (Molecular Devices, San Jose, CA), con una banda di eccitazione di 445-455nm, una banda di emissione di 518-538 nm e un’impostazione di sensibilità pari a 145.

Fig. 5–Le misurazioni TEER dei tessuti EpiIntestinal™ coltivati in piastre PermaCell a 96 pozzetti sono più coerenti con il sistema di misurazione EVOM™ Auto rispetto a EVOM™ Manual e possono essere raccolte più rapidamente, per una maggiore facilità d’uso. A) Le letture EVOM™ Auto erano più riproducibili e il tempo necessario per misurare la piastra si è ridotto drasticamente rispetto a EVOM™ Manual. B) I valori TEER ottenuti con EVOM™ Manual erano meno stabili durante il periodo di misurazione rispetto a quelli ottenuti con EVOM™ Auto, che sono aumentati moderatamente durante le misurazioni manuali (p