VIDEO: Recensione di un ricercatore dell’EVOM3

di Benjamin Dubansky, PhD, fisiologo animale/ricercatore

EVOM è un tipo speciale di voltmetro che misura le proprietà elettriche attraverso uno strato di cellule in coltura o una membrana biologica. È il sistema commerciale più utilizzato per effettuare misurazioni attraverso uno strato di cellule in coltura. Misuriamo la TEER (TER) - resistenza elettrica transepiteliale. L’EVOM3 consente di esaminare più da vicino e misurare la resistenza o la tensione attraverso queste membrane o cellule in coltura.

Perché è stato inventato?

L’EVOM (misuratore di volt e ohm epiteliale) è stato progettato negli anni ’80. È stato inventato quando sono state introdotte le piastre per colture multiwell. Poco dopo sono arrivati gli inserti permeabili, che consentono di sospendere uno strato di cellule in un mezzo di coltura.

Quando si inseriscono le cellule in questi inserti permeabili, si dividono e formano uno strato confluente attraverso l’inserto, altrimenti permeabile. Man mano che le cellule crescono fino a raggiungere la confluenza, è possibile usare EVOM per osservare l’aumento della resistenza fino al raggiungimento di un plateau. Una volta ottenuto uno strato compatto e confluente con giunzioni intercellulari, si possono iniziare gli esperimenti.

Quali esperimenti si possono fare con un EVOM3?

Di tutto! Una volta ottenuto un monostrato confluente con giunzioni intercellulari su un substrato permeabile, si ha essenzialmente uno strato di epitelio con le proprietà di barriera e di trasporto di una membrana biologica, ma in coltura. Si può aggiungere una sostanza su un lato e monitorarne il trasporto o la risposta cellulare.

Ciò significa che si possono studiare le proprietà di barriera degli endoteli, come la barriera emato-encefalica, monitorando la permeabilità ai farmaci, oppure gli effetti degli xenobiotici negli studi di tossicità attraverso strati di cellule epiteliali. EVOM3 è in grado di gestire migliaia di applicazioni di base, inclusi studi meccanicistici per individuare i meccanismi di trasporto dei canali ionici, il trasporto mediato dai recettori, il trasporto paracellulare, le giunzioni intercellulari, la guarigione delle ferite, il rimodellamento e molto altro. Una volta posizionate sugli inserti, le cellule possono anche essere sottoposte a imaging.

In che modo EVOM3 è simile a una camera di Ussing?

Può sembrare simile alla camera di Ussing, ma non lo è del tutto. La camera di Ussing produce un campo uniforme attraverso la membrana, consentendo di applicare una tensione costante attraverso l’epitelio e di monitorare in modo più uniforme l’intero strato epiteliale. La camera di Ussing è pensata soprattutto per tessuti espiantati. Per esempio, si può prelevare un pezzo di intestino e coltivarlo in una camera di Ussing per studiare il trasporto o le proprietà di barriera, come descritto sopra. Lo svantaggio della camera di Ussing è che si possono analizzare solo pochi campioni alla volta. Una camera di Ussing non è certo una piastra da 24 pozzetti. Esistono modi per adattare EVOM3 e ottenere dati simili a quelli della camera di Ussing con una produttività maggiore. Anche se EVOM3 non è preciso quanto una camera di Ussing, è comunque una piattaforma affidabile, con una produttività molto superiore.

Il modo più semplice per usare EVOM3 è effettuare le misurazioni durante un esperimento, per monitorare eventuali cambiamenti nel corso di un trattamento. In alternativa, si può usare la configurazione degli elettrodi EndOhm . Anche se EVOM3 non è preciso quanto la camera di Ussing, con la serie EVOM si possono comunque ottenere dati simili a quelli della camera di Ussing, soprattutto con i modelli più recenti (EVOM3).

Perché EVOM3 è molto meglio dei modelli precedenti?

EVOM3 è più veloce

La nuova versione, come si può immaginare, è molto più veloce. Fornisce i valori più rapidamente, perché occorre meno tempo prima che si stabilizzino. Questo rende molto più semplice esaminare un’intera piastra. La maggiore velocità consente di misurare più volte la stessa piastra per monitorare i cambiamenti durante un esperimento in modo molto più efficace rispetto al passato.

Regolazione della resistenza

È anche possibile regolare la resistenza target. Potrebbe non sembrare importante, ma lo è. L’epitelio delle vie aeree o il microcircolo hanno una resistenza molto bassa (100 Ω/cm²), mentre la barriera emato-encefalica può raggiungere diverse migliaia di ohm (5.000 Ω/cm²). Anche i diversi sistemi hanno caratteristiche diverse.

• Temperatura (37°C vs temperatura ambiente)
• Numero di passaggi cellulari
• Mezzo di coltura (incide moltissimo)
• Tempo di attesa dopo il raggiungimento della confluenza
• Configurazione degli elettrodi

Il nuovo EVOM3 dispone di una funzione automatica per individuare gli intervalli target, che possono cambiare man mano che le cellule crescono fino a raggiungere la confluenza. Se si cerca di coltivare una nuova linea cellulare, probabilmente non si conoscono gli intervalli di resistenza previsti e i valori potrebbero essere diversi da quelli riportati, a causa dei fattori sopra menzionati. Lo dico per via delle mie esperienze traumatiche con le colture cellulari. Nel nostro caso, durante il dottorato, lavoravamo con colture primarie di cellule branchiali di pesce. Non era un modello facile. Per misurare la resistenza target delle branchie di pesce, il vecchio EVOM che avevamo richiedeva una personalizzazione da parte del produttore.

Oggi il nuovo EVOM3 può passare da una corrente di misurazione all’altra, tra diverse opzioni, a seconda degli intervalli di resistenza target; dispone anche di un’impostazione automatica per individuare gli intervalli di resistenza. È molto più versatile per le colture primarie o se si prevede di usare più tipi di cellule.

Design pratico

Molti strumenti hanno interruttori a pedale, perché lasciano le mani libere. In questo caso, consentono di non toccare nulla, riducendo al minimo il rischio di contaminazione. L’interruttore a pedale registra anche la misurazione. Ogni volta che si è pronti a registrare una misurazione, basta premere il pedale e il valore viene inserito.

La parte interessante è che i dati vengono registrati in un foglio di calcolo man mano che si passa da un pozzetto all’altro. Non serve annotare nulla, così si hanno le mani libere e non è necessario entrare e uscire dalla cappa. Questo migliora davvero l’efficienza del flusso di lavoro. Dovreste vedere i miei quaderni di laboratorio! Di solito bisogna comunque inserire i dati in un foglio di calcolo. Ora vengono salvati automaticamente su un’unità flash in formato CSV.

Nuovo design degli elettrodi

Molti fattori possono causare incongruenze nelle letture (temperatura, mezzo di coltura, materiali di consumo, tempo, piastre ed elettrodi). I vecchi elettrodi STX2, usati nella maggior parte dei casi, richiedono una mano ferma; in passato, se non si tenevano gli elettrodi sempre nello stesso modo (profondità, angolazione ecc.), si rischiava di ottenere dati incoerenti. Ora gli elettrodi sono fissati a una guida che si adatta all’inserto del pozzetto. Quando si inseriscono gli elettrodi in ciascun pozzetto, si trovano sempre nella stessa posizione, alla stessa profondità e alla stessa distanza l’uno dall’altro. Si può impostare l’allineamento una sola volta e procedere lungo la piastra sapendo che le misurazioni saranno uniformi. Questo fa risparmiare moltissimo tempo. È semplicemente molto più facile da usare.

Risoluzione migliore, touchscreen, sottrazione del valore di fondo

Ecco altri vantaggi di EVOM3.

• La risoluzione è migliore, come ci si aspetterebbe.
• Il display moderno e l’interfaccia touchscreen semplificano l’uso.
• È possibile sottrarre i valori di controllo. È comodo.
• Poiché è molto più veloce e gli elettrodi forniscono valori più uniformi, con letture stabili e una buona gestione dei dati, è possibile eseguire rapidamente esperimenti temporizzati.
• I calcoli della TEER sono semplici. Basta moltiplicare la resistenza per l’area superficiale dell’inserto o dello strato cellulare. Si può ripetere la misurazione nel tempo e osservare i cambiamenti nelle giunzioni intercellulari, come le giunzioni strette; i risultati saranno semiquantitativi, ma comunque significativi.

NOTA: se occorre una maggiore precisione, è possibile usare la configurazione degli elettrodi EndOhm, che si collega a EVOM3. In questo caso bisogna rimuovere l’inserto e collocarlo in una camera con elettrodi perfettamente allineati, un po’ come in una camera di Ussing. È un sistema ben progettato per ottenere misurazioni rapide e uniformi. Sarà necessario spostare gli inserti. Il processo è più lento, ma se si pulisce bene e si mantiene la sterilità del lavoro, gli elettrodi ENDOHM sono eccezionali. Sono decisamente più lenti, quindi la produttività è inferiore, ma sono comunque molto più veloci di una camera di Ussing. E si lavora con cellule in coltura, il che non è poco. 

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