Quantificazione dell’integrità della barriera nelle piattaforme organ-on-chip
La piattaforma EVOM™ Chip fornisce misurazioni TEER in tempo reale e ad alta fedeltà, che consentono di rilevare la maturazione della barriera e le alterazioni infiammatorie nei modelli endoteliali e BBB, permettendo una valutazione standardizzata e scalabile della funzione di barriera nei sistemi microfisiologici.
Abstract
La valutazione quantitativa in tempo reale dell’integrità della barriera è fondamentale per modellare la fisiologia neurovascolare e la funzione della barriera emato-encefalica (BBB) in vitro. In questo studio, la piattaforma EVOM™ Chip è stata utilizzata per monitorare la resistenza elettrica transendoteliale (TEER) sia in un modello di endotelio vascolare sia in modelli primari di tri-coltura BBB. Le misurazioni TEER hanno dimostrato una robusta formazione della barriera nel tempo e hanno rilevato una significativa alterazione della barriera in seguito all’esposizione alla citochina proinfiammatoria fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Questi risultati confermano che la piattaforma EVOM™ Chip è una soluzione altamente sensibile, standardizzata e scalabile per rilevare le sottili dinamiche della barriera e le risposte infiammatorie in modelli avanzati di coltura cellulare.
Introduzione
I tessuti che formano barriere, come l’endotelio vascolare e la BBB, regolano strettamente lo scambio molecolare e l’omeostasi tissutale; la loro integrità è quindi un parametro fondamentale nella modellizzazione delle malattie, nella scoperta di farmaci e nei test di tossicità. La TEER è un metodo ampiamente adottato e non invasivo per quantificare la formazione della barriera e rilevarne le alterazioni. La piattaforma EVOM™ Chip integra elettrodi incorporati nei formati dei sistemi microfisiologici, per fornire misurazioni TEER sensibili e riproducibili, eliminando la variabilità manuale e consentendo un monitoraggio continuo e senza intervento manuale. EVOM™ Chip fornisce informazioni in tempo reale e ad alta fedeltà sulle dinamiche della barriera cellulare, definendo al contempo un approccio standardizzato alla misurazione TEER.
Questa nota applicativa mostra come viene utilizzata la piattaforma EVOM™ Chip per:
- Monitorare la maturazione della barriera endoteliale in monoculture di cellule endoteliali vascolari del cordone ombelicale umano (HUVEC), mediante misurazione TEER multiplexata su chip e senza intervento manuale.
- Valutare lo sviluppo della BBB in un modello primario di tri-coltura sulla piattaforma SynBBB.
- Quantificare l’alterazione infiammatoria della barriera indotta dalle citochine, usando la TEER come indicatore della compromissione funzionale.
Materiali e metodi
Le HUVEC sono state coltivate su dispositivi EVOM™ Chip e monitorate per 48 ore per valutare la formazione della barriera. È stato allestito un modello primario di BBB composto da cellule endoteliali, astrociti e periciti, quindi coltivato per 72 ore per favorire lo sviluppo e la maturazione della barriera. Dopo la formazione della barriera, le colture sono state trattate con TNF-α (10 ng/mL) per indurre un’alterazione della barriera. L’integrità della barriera è stata valutata quantificando la TEER sulla piattaforma EVOM™ Chip, misurando la resistenza elettrica attraverso la barriera cellulare.
Analisi statistica
I dati sono presentati come media ± SEM. Monocoltura HUVEC, n = 7; tri-coltura SynBBB, n = 15. Per valutare la significatività statistica è stata utilizzata un’ANOVA a una via con confronti multipli. È stata applicata una soglia di significatività di p < 0.05. Livelli di significatività: *** p < 0.001; **** p < 0.0001.
Risultati
A. EVOM™ Chip quantifica la formazione della barriera HUVEC e la sua alterazione mediata dalle citochine. I valori di resistenza basale erano in media di circa 15 kΩ. Dopo 48 -ore di coltura, la TEER è aumentata significativamente fino a circa 36 kΩ, indicando la corretta formazione di una barriera endoteliale compatta. L’esposizione a TNF-α (10 ng/mL) per 4 -ore ha ridotto la resistenza a circa 29–30 kΩ, dimostrando una perdita misurabile di integrità della barriera.
- I valori TEER sono più che raddoppiati durante la maturazione del monostrato, riflettendo la rapida formazione di una barriera endoteliale altamente integra.
- L’esposizione a TNF α ha provocato una riduzione rapida e quantificabile della TEER, dimostrando la capacità della piattaforma di rilevare la degradazione acuta della barriera causata dall’infiammazione.
- Sono state osservate differenze statisticamente significative tra tutti i gruppi sperimentali, nonostante la ridotta dimensione del campione (n=7, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
Fig. 1 Monocoltura HUVEC sulla piattaforma EVOM™ Chip
B. EVOM™ Chip quantifica la formazione e il danno della complessa barriera BBB. La piattaforma SynBBB è stata utilizzata per coltivare cellule primarie di BBB in tri-coltura, mostrando una progressiva maturazione della barriera, con un aumento della TEER da circa 14–15 kΩ al basale a circa 25–26 kΩ dopo 72- -ore di coltura. Dopo l’esposizione a TNF-α, la resistenza è diminuita a circa 21–22 kΩ, indicando un’alterazione dell’integrità della BBB.
- Il modello primario di tri-coltura ha mostrato un rafforzamento della BBB fisiologicamente rilevante nell’arco di 72 ore, coerente con le interazioni coordinate tra cellule endoteliali, astrociti e periciti.
- La stimolazione con citochine ha indotto una chiara riduzione della TEER, confermando la reattività del modello allo stress infiammatorio e la sensibilità della piattaforma a sottili alterazioni della BBB.
- Sono state osservate differenze statisticamente significative tra tutti i tempi di misurazione, (n=15, ***p < 0.001, ****p < 0.0001).
Discussione
La misurazione accurata e quantitativa dell’integrità della barriera è fondamentale per studiare la biologia vascolare e modellare i meccanismi delle malattie neurovascolari. L’integrazione diretta della TEER nei sistemi organ-on-chip attraverso l’architettura a elettrodi incorporati di WPI offre un notevole vantaggio rispetto alle tradizionali sonde portatili, che richiedono il posizionamento manuale, introducono variabilità tra operatori e alterano le condizioni di coltura a ogni misurazione. Gli elettrodi incorporati rimangono fissi nel dispositivo, consentendo un monitoraggio continuo, non invasivo e senza intervento manuale, con geometria degli elettrodi costante e stabilità del segnale superiore, elementi fondamentali per rilevare cambiamenti sottili nella funzione di barriera. Sia nelle monoculture endoteliali sia nelle tri-colture, questo approccio ha rilevato chiari aumenti della TEER durante la maturazione della barriera e rapide diminuzioni in seguito a stimoli infiammatori, dimostrando l’importanza di integrare la TEER come misura funzionale in tempo reale. L’integrazione della misurazione TEER direttamente nella piattaforma di coltura assicura dati di qualità superiore, maggiore riproducibilità e un’interpretazione più accurata delle dinamiche della barriera in risposta a stimoli biologici o farmacologici.
Qui dimostriamo che EVOM™ Chip è in grado di rilevare con sensibilità gli aumenti della TEER che riflettono la maturazione della barriera sia nei modelli cellulari in monocoltura sia in quelli in tri-coltura su chip microfluidici SynBBB, oltre a quantificare l’effetto delle citochine nell’indurre una risposta infiammatoria e danneggiare la BBB. In entrambi i modelli, dopo il trattamento con TNF-α è stata osservata una diminuzione della TEER, coerente con l’alterazione delle giunzioni strette mediata dalle citochine e con l’aumento della permeabilità della barriera.
Questi risultati dimostrano che la piattaforma EVOM™ Chip offre un metodo sensibile, riproducibile e non invasivo per monitorare le dinamiche della barriera in una serie di modelli in vitro. Questa tecnologia pone le basi per misure TEER standardizzate nei modelli di barriera specifici per organo, rendendo possibili applicazioni nello screening farmacologico [incluso lo screening ad alto rendimento con
Questi risultati confermano che la piattaforma EVOM™ Chip è in grado di rilevare con sensibilità sia la formazione della barriera sia la disfunzione indotta dalle citochine nelle monoculture endoteliali e nelle tri-colture BBB.
