Esplorare il mondo intracellulare
Autore collaboratore: Dr. Steve Andre (fisiologo muscolare)
Tutte le cellule viventi mantengono una differenza di carica elettrica tra le soluzioni presenti all’interno e all’esterno delle membrane cellulari. La differenza di tensione attraverso la membrana cellulare si mantiene generalmente a un livello costante, noto come potenziale di membrana a riposo. Il potenziale di membrana a riposo è prodotto dalla distribuzione differenziale degli ioni sui due lati della membrana. Nelle fibre muscolari, la concentrazione di potassio all’interno della cellula è oltre 50 volte superiore a quella dello ione nel liquido extracellulare. D’altra parte, la concentrazione di sodio all’esterno della membrana è 10 volte superiore a quella all’interno. Il gradiente di concentrazione del potassio è maggiore e orientato nella direzione opposta rispetto al gradiente di concentrazione del sodio. Le concentrazioni ioniche sono regolate da tre fattori:
- Pompa sodio-potassio
- Velocità relative di diffusione di questi ioni lungo i gradienti di concentrazione
- Attrazione e repulsione tra cariche opposte e uguali
Pompa sodio-potassio
La pompa sodio-potassio trasporta attivamente il sodio fuori dalla cellula e il potassio al suo interno. Normalmente, la cellula contiene più K+ all’esterno e più Na+ all’interno. La pompa stabilisce e mantiene i gradienti di concentrazione di questi due ioni attraverso la membrana cellulare. I gradienti di concentrazione formano una batteria ionica attraverso la membrana, e la pompa sodio-potassio mantiene carica questa batteria. Per visualizzare un’animazione di questo processo, visita:
Il potenziale di membrana a riposo, che nella maggior parte delle cellule varia tra -50 e -90mV, è il risultato della diffusione del potassio. A causa del suo ampio gradiente di concentrazione, il potassio diffonde attraverso la membrana più rapidamente di qualsiasi altro ione. Quando il potassio diffonde fuori da una cellula:
- All’interno della cellula si accumulano cariche negative in eccesso
- Gli ioni potassio extracellulari attraggono gli ioni negativi che li seguono
- Gli ioni potassio extracellulari respingono gli ioni positivi esterni, spingendoli di nuovo all’interno della cellula.
Poiché la permeabilità agli altri ioni è relativamente bassa, questi non si muovono con la stessa rapidità degli ioni potassio. Pertanto, hanno solo un effetto limitato sulla neutralizzazione del potenziale negativo all’interno della cellula. Anche il movimento netto del potassio è limitato dalla differenza di potenziale che si crea tra l’interno e l’esterno della cellula. La negatività all’interno della cellula trattiene gli ioni potassio positivi. All’equilibrio, uno ione potassio viene spinto fuori dalla cellula attraverso un canale da una forza chimica (gradiente di concentrazione) che ha la stessa intensità della forza elettrica (potenziale negativo) che lo richiama all’interno della cellula. Il potenziale di membrana dipende dalle concentrazioni dei diversi ioni ai due lati della membrana e dalla permeabilità relativa della membrana a questi ioni.
Microelettrodi di vetro
I potenziali di membrana a riposo, d’azione, recettoriali lenti e sinaptici si misurano con un elettrometro intracellulare come il Duo773 di WPI, utilizzando micropipette di vetro riempite di liquido e dotate di punta sottile, note come microelettrodi.
Amplificatore per microelettrodi
È fondamentale che le impedenze della cellula, del microelettrodo e dell’amplificatore siano correttamente abbinate. In caso contrario, il segnale può andare perso. Per preservare l’ampiezza del segnale, nel circuito tra il microelettrodo e l’unità di registrazione si usa un amplificatore CC ad alta impedenza, noto come elettrometro intracellulare o amplificatore per microelettrodi, come il Duo773 di WPI.
Questo tipo di amplificatore abbina l’impedenza del microelettrodo a quella d’ingresso dell’unità di registrazione tramite un circuito noto come inseguitore di tensione. Gli elettrometri hanno solitamente impedenze d’ingresso pari o superiori a 1010Ω. In genere, l’impedenza d’ingresso di un elettrometro dovrebbe essere almeno 100 volte superiore a quella del microelettrodo utilizzato per la registrazione. La ridotta area della sezione trasversale della punta del microelettrodo limita notevolmente il flusso di corrente attraverso l’elettrodo. Per questo si dice che questo tipo di elettrodo ha un’impedenza elevata. Ciò significa che la misurazione dei potenziali di cellule più piccole con microelettrodi dotati di punte più piccole e impedenze più elevate richiede l’uso di elettrometri con impedenze d’ingresso maggiori.
Oltre ad avere impedenze d’ingresso elevate, gli elettrometri hanno impedenze d’uscita basse, più vicine alle basse impedenze d’ingresso delle unità di registrazione. Ciò significa che le ampiezze effettive dei potenziali di membrana registrati con gli elettrometri corrispondono a quelle visualizzate dai registratori. Poiché questi segnali richiedono poca o nessuna amplificazione, agli elettrometri bastano guadagni d’uscita di X1 o X10.
Per i normali potenziali d’azione a riposo (–50 to –90mV), usa un guadagno X1. Per i potenziali sinaptici, che di solito rientrano nell’intervallo 5-10mV, usa un guadagno X10.
NOTA: gli elettrometri non captano il rumore dovuto alle radiazioni elettriche con la stessa facilità degli altri tipi di amplificatori.
Un elettrometro intracellulare di buona qualità presenta alcune caratteristiche, come un circuito di compensazione della capacità e un «tickler».
Compensatore della capacità
Il circuito di compensazione della capacità, noto anche come ponte, neutralizza l’effetto della membrana cellulare, che normalmente agisce da condensatore trattenendo una carica. Quando si inietta un impulso elettrico in una cellula, le onde quadre iniettate presentano angoli arrotondati, perché la membrana cellulare attenua la corrente iniettata. L’uso di un circuito di compensazione della capacità rende più netti gli angoli dell’onda quadra iniettata, depolarizzando la membrana cellulare. Il risultato è un impulso iniettato più efficace. I potenziali d’azione iniettati producono tempi di risposta più rapidi e un’onda registrata fedele a quella iniettata. Il circuito di compensazione della capacità sottrae l’effetto della membrana cellulare sul potenziale iniettato.
Tickler
Il tickler invia un impulso di corrente rapido e netto attraverso il microelettrodo. Noto anche come ringer, il tickler ha due funzioni. Se il microelettrodo si trova all’esterno della cellula, può essere usato per pulire la punta dell’elettrodo. Quando il microelettrodo viene premuto contro la cellula, formando una piccola fossetta, l’attivazione del tickler aiuta il microelettrodo a penetrare la membrana cellulare.
