Compteur manuel EVOM™ pour mesure TEER avec enregistrement automatique des données

La fonction de soustraction est utilisée lorsque vous souhaitez éliminer toute mesure qui ne provient pas de la membrane, comme les résistances de l'électrode et du fluide.

Non, la mesure TEER nécessite un calcul de surface. Pour calculer le TEER, multipliez la résistance mesurée par la surface appropriée (ci-dessous). Par exemple, un insert de 12 mm mesure 565 Ω, le TEER est 565 Ω × 1,13 cm2 = 638,5 Ω-cm2. Voici les surfaces généralement applicables aux différents formats de transwell/insert : plaque 6 puits (inserts de 24 mm) 4,52 cm2, plaque 12 puits (inserts de 12 mm) 1,13 cm2, plaque 24 puits (inserts de 6,5 mm) 0,33 cm2, plaque 96 puits (inserts de 4,3 mm) 0,14 cm2. Pour les mesures TEER automatisées, envisagez d’utiliser le système de mesure TEER automatisé WPI REMS.

Effacez toutes les données en mémoire en ouvrant les paramètres, le menu de stockage puis en appuyant sur nouvelle plaque, cela effacera toutes les lectures précédentes. Revenez à l'écran principal, ouvrez l'écran d'aperçu, sélectionnez chaque puits à mesurer (la sélection devient verte), placez l'électrode, puis mesurez. Une fois les mesures des puits sélectionnés terminées, ouvrez les paramètres, appuyez sur le menu de l'écran de stockage, puis appuyez sur enregistrer nouveau pour sauvegarder les données de la plaque sur la clé USB.

Retirez le manuel EVOM™ de la hotte à flux laminaire après utilisation. La prochaine fois, allumez la lumière UV à l'intérieur de la hotte. Une fois la hotte désinfectée par UV, éteignez la lumière UV, puis vaporisez 70-100 % d’éthanol ou d’isopropanol sur un essuie-tout et essuyez le manuel EVOM™. Ne vaporisez pas l’alcool directement sur le manuel EVOM™.

Vous pouvez vous attendre à voir une variation des valeurs brutes de résistance. Cependant, vous soustrayez les valeurs de blanc (Transwell vide sans cellules) des valeurs des échantillons (Transwell avec cellules). De cette façon, vous soustrayez la valeur de blanc avec volume augmenté des échantillons avec volume augmenté. Ainsi, toute variation de résistance due à l'augmentation du volume est éliminée. Utilisez systématiquement les mêmes volumes pour tous vos échantillons dans une expérience.

Dérive – Mesures qui augmentent ou diminuent continuellement de manière significative (tension ou résistance) au fil du temps. Exemple : À 1000 Ω, la lecture augmente de 100 Ω/minute. (Une dérive de 10 Ω/minute est acceptable.) Une dérive excessive peut être causée par des variations de pH ou de température, ou l’électrode nécessite un nettoyage.

Plusieurs facteurs peuvent être à l’origine de cette dérive.

• Assurez-vous que les électrodes sont entièrement immergées dans la solution du milieu de culture, et que la température du liquide dans la plaque est constante en équilibrant à température ambiante ou en utilisant un chauffe-plaque.
• Une autre cause fréquente de dérive est la présence de dépôts des constituants du milieu de culture sur les pointes des électrodes.
• Les électrodes (pointes) nécessitent un nettoyage enzymatique (Tergazyme ou Enzol) périodiquement, jusqu’à 1 fois par semaine selon l’utilisation.
• Les électrodes portables doivent également être maintenues aussi immobiles que possible pendant une mesure.
• Un mouvement excessif provoquera des fluctuations dans la mesure.
• De plus, dans un environnement à 5 % de CO2, une perte de CO2 entraîne une modification du pH du milieu, ce qui peut faire varier la lecture de la résistance. Cela s’applique principalement dans le cadre d’une mesure continue sur une longue période (heures, par opposition à quelques minutes).

La température est connue pour affecter les valeurs TEER. Nous recommandons de maintenir une température constante pour obtenir des valeurs cohérentes. Étant donné que les mesures sont effectuées dans un milieu de culture cellulaire / tampon, nous recommandons d'utiliser un bain-marie à température fixe pour réchauffer le milieu/tampon utilisé pendant l'expérience. Une température constante du milieu/tampon garantit des conditions expérimentales stables. Nous recommandons de sortir la plaque à puits, contenant des cellules cultivées sur des inserts de culture, de l'incubateur pendant au moins 20 minutes afin de stabiliser la plaque à température ambiante avant de réaliser les mesures. 

Si vous utilisez une chambre EndOhm, assurez-vous de maintenir la même distance fixe entre les électrodes supérieure et inférieure pour obtenir des lectures cohérentes. Si vous utilisez une électrode en baguette (STX2), essayez de la tenir en position verticale lors de la prise des mesures. La cohérence dans le maintien de la même position de tenue des électrodes en baguette pendant l'expérience devrait permettre d'obtenir des lectures constantes.

Nous recommandons d'utiliser le même fluide avec la même concentration ionique à la fois du côté apical (par exemple, le dessus d'un insert de culture cellulaire) et du côté basolatéral (par exemple, la partie inférieure de l'insert de culture cellulaire placé dans un puits d'une plaque de 12 puits). Lors de la mesure, si vous utilisez un tampon PBS 1X du côté apical, nous recommandons d'utiliser également un tampon PBS 1X du côté basolatéral. Nous recommandons aussi que les niveaux des fluides (à l'intérieur et à l'extérieur des inserts de culture cellulaire) soient à la même hauteur afin de minimiser les différences de pression. Pendant les expériences, le puits/côté apical est rempli en premier avec le fluide pour éviter le délogement de la membrane du filtre par les pressions hydrostatiques.

L'application de volumes constants de fluide (milieu/tampon) lors de toutes les expériences réduira la variabilité des données.

Le EVOM2 fonctionne sur le principe que, une fois que vous mesurez ce que nous appelons le « puits », cette première mesure de résistance contient la somme de la résistance de l'électrode, de l'écart entre les électrodes et de la résistance due au volume et à la molarité du milieu liquide. (Toute différence de charge d'électrode est annulée par la méthode de mesure du EVOM2qui inverse la polarité et fait la moyenne des résultats.)

Les mesures périodiques successives du puits tracent la croissance de la membrane par une mesure de résistance, et une fois que ce graphique de résistance s'est stabilisé, on peut dire que la membrane a atteint la confluence. Le EVOM2 fonctionne comme un amplificateur à clampage de tension et système Ussing, mais sans la chambre Ussing spéciale.

Le EVOM2 Le système n'est pas aussi précis qu'un Ussing, mais son but est de déterminer si une membrane est confluente, pas de réaliser une analyse détaillée. (Certaines analyses de perméabilité membranaire peuvent être étudiées par le EVOM2 système, mais en pourcentage de changement plutôt qu'en valeur absolue de changement.) EVOM2  system, but as a percent of change rather than an absolute value of change.)

Plusieurs variables expérimentales influencent les résultats TEER, telles que :

• Température,
• État et positionnement des électrodes,
• Type de cellules et conditions de culture,
• Composition du milieu

Parce que les cellules se développent et forment une monocouche serrée. Initialement, la TEER est faible après le semis, puis augmente à mesure que les cellules se multiplient et couvrent les espaces de la membrane, formant une barrière confluente.

La TEER est largement utilisée pour évaluer la fonction de barrière cellulaire et la perméabilité dans : les études de perméabilité et d’absorption des médicaments, la recherche sur la barrière hémato-encéphalique, les tests de toxicité et de cytotoxicité, ainsi que la surveillance des tissus et des cultures cellulaires.

Non — TEER est non destructif. Il permet des mesures répétées dans le temps pour surveiller l'intégrité de la barrière sans endommager les cellules.

TEER élevé → Barrière cellulaire forte et intacte.

TEER faible → Couche cellulaire faible ou perméable.

Dans certains modèles (par exemple, les cellules alvéolaires), un tampon/milieu peut être nécessaire pour une mesure précise.

Non. TEER est la résistance normalisée par la surface de croissance cellulaire (Ω·cm²), calculée à partir de la lecture brute de la résistance.

Ne tenez PAS l’électrode par le câble. Cela peut progressivement casser les connexions internes.

Tenez l’électrode par la zone fléchée (plastique).

Limitez l’immersion ou la pulvérisation de liquide jusqu’à ce niveau (maximum). Vous ne voulez pas que le liquide pénètre à l’intérieur et atteigne les câbles ou connecteurs internes. Vous pouvez essuyer le reste de l’électrode avec un essuie-tout vaporisé d’isopropanol ou d’éthanol (ne pas vaporiser directement).

Si vous constatez une instabilité à 500 Ω, la lecture passe de 450 à 550 Ω et ne se stabilise pas (une instabilité de ±5 Ω est acceptable dans la plage de 500 Ω). Dans les plages supérieures, jusqu'à ±1000 Ω est acceptable dans la plage de 100K. Les électrodes présentant une instabilité peuvent nécessiter un nettoyage enzymatique.

• Les causes les plus courantes d'instabilité de lecture peuvent être corrigées en immergeant complètement les pointes dans la solution ou en effectuant un nettoyage enzymatique.
• Les pointes des électrodes ne sont pas complètement immergées dans un liquide conducteur adéquat (milieu ou tampon). Ajoutez du liquide supplémentaire pour amener le niveau du liquide jusqu'aux pointes des électrodes. (Utilisez des volumes apicaux et basolatéraux cohérents pour faire des comparaisons fiables.) Les pointes des électrodes (zone de détection) peuvent avoir des dépôts de constituants du milieu de culture cellulaire, ce qui peut être résolu par un nettoyage enzymatique.

Oui, nous avons deux séries d'EndOhms. Les EndOhms Legacy EVOM2 (ENDOHM-6G, ENDOHM-12G, ENDOHM-24G-SNAP) utilisent le câble 53330-01, et les EndOhms plus récents (EVM-EL-03-01-0x) compatibles avec le manuel EVOM™ utilisent le câble 99916.