NOTA DE APLICACIÓN: Observación de la mitosis usando Celloger® Mini Plus

Introducción

En el proceso del ‘ciclo celular’, las células crecen y se dividen en dos células hijas genéticamente idénticas. Está regulado por una vía de señalización compleja que mantiene la homeostasis celular regulando la división celular y la duplicación del ADN¹. Por otro lado, debido a que las células cancerosas crecen y se dividen indefinidamente fuera del control del ciclo celular, se utilizan fármacos anti-mitóticos para suprimir la proliferación anormal de las células cancerosas². En particular, se sabe que el Nocodazol es un fármaco anti-mitótico representativo para el tratamiento del cáncer, y tiene la característica de alterar la dinámica de los microtúbulos durante la división citoplasmática y nuclear^3,4.

En el presente estudio, examinamos la actividad anti-mitótica del nocodazol contra una línea celular cancerosa monitoreando el proceso de división celular. Para ello, las células HeLa fueron transfectadas de forma estable con la proteína fluorescente verde fusionada a la histona 2B (H2B-GFP), que visualiza la dinámica de la estructura cromosómica durante la progresión del ciclo celular⁵. Luego, la división celular fue monitoreada en tiempo real tras tratar las células con o sin nocodazol usando Celloger® Mini Plus, un dispositivo de imagen en células vivas.

Método

Las células HeLa transfectadas con el plásmido H2B-GFP se sembraron en una placa de 24 pocillos a 4 x 10⁴ células/pocillo. Las células se cultivaron con 10% de suero fetal bovino y medio Dulbecco modificado de Eagle al que se añadió 300 ug/mL de G418. Después de un cultivo nocturno para que las células se adhirieran, se incubaron con o sin 62.5 nM de nocodazol, y se realizó la imagen en tiempo real usando Celloger® Mini Plus (campo claro y canal de fluorescencia verde, óptica 10X). Se tomaron imágenes cada 15 minutos durante 24 horas.

Resultados

Se realizó imagen en lapso de tiempo en campo claro y fluorescencia de células HeLa transfectadas con H2B fusionada a proteína fluorescente verde para observar cambios nucleares en mitosis. En la imagen de campo claro, la membrana nuclear era claramente visible al inicio, luego desapareció gradualmente y se observó la metafase donde los cromosomas se alinearon en el centro de la célula tanto en imágenes de campo claro como de fluorescencia (Figura 1A). En este punto, los cromosomas estaban condensados y la fluorescencia se intensificó en comparación con la etapa anterior. Los cromosomas que entraron en la etapa posterior se separaron en dos cromátidas hermanas y cada una se movió hacia polos opuestos de la célula. Y como se muestra en la última imagen, finalmente se generaron dos células hijas en telofase. Por el contrario, en las células tratadas con nocodazol, el proceso de división celular no avanzó más ya que las cromátidas no pudieron dividirse hacia ambos extremos. En la imagen de campo claro, las células dejaron de adherirse al fondo, y se confirmó que el ADN finalmente se fragmentó, lo que resultó en apoptosis en la imagen de fluorescencia (Figura 1B). 

Figura 1. Imágenes en lapso de tiempo de células HeLa transfectadas con H2B-GFP con o sin nocodazol.

Conclusión

El marcado fluorescente es una herramienta útil para observar la dinámica de los orgánulos en células vivas. Hasta ahora, se han desarrollado plásmidos para observar diversos orgánulos o proteínas objetivo usando proteínas de fusión fluorescentes, y se han realizado muchos estudios para verificar los cambios en orgánulos o la translocación de proteínas inducidos por diversas estimulaciones. 

En esta nota de aplicación, realizamos un método de marcado nuclear usando histona y proteína de fusión fluorescente verde que se une al ADN. Para confirmar el efecto del nocodazol en la división celular, se monitorearon las células a lo largo del tiempo y se adquirieron imágenes usando Celloger® Mini Plus, un dispositivo de imagen en células vivas en tiempo real. El sistema cuenta con una cámara totalmente motorizada que permite la imagen en varias posiciones a intervalos programados por el usuario. Esto hace posible seguir los cambios en cada célula bajo diferentes condiciones. 

Referencias

1. Mills, Christopher C., E. A. Kolb, y Valerie B. Sampson. "Development of Chemotherapy with Cell-Cycle Inhibitors for Adult and Pediatric Cancer Therapy Combination Therapies for Cancer." Cancer research 78.2 (2018): 320-325. 
2. Otto, Tobias, y Piotr Sicinski. "Cell cycle proteins as promising targets in cancer therapy." Nature Reviews Cancer 17.2 (2017): 93-115. 
3. Blagosklonny, Mikhail V. "The power of chemotherapeutic engineering: arresting cell cycle and suppressing senescence to protect from mitotic inhibitors." Cell cycle 10.14 (2011): 2295-2298.4. Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one 
4. Endo, Kingo, et al. "Nocodazole induces mitotic cell death with apoptotic-like features in Saccharomyces cerevisiae." FEBS letters 584.11 (2010): 2387-2392. 
5. Anda, Teru, Kevin F. Sullivan, y Geoffrey M. Wahl. "Histone–GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells." Current Biology 8.7 (1998): 377-385. 

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