NOTA DE APLICACIÓN: Análisis de la Citotoxicidad Inducida por Nocodazol Usando Celloger® Mini Plus
Introducción
La citotoxicidad se refiere al grado de daño a las células causado por sustancias químicas o factores físicos. Medirla mediante un ensayo de citotoxicidad es esencial para el desarrollo de fármacos e investigaciones biológicas. Las células atraviesan vías de señalización complejas que provocan diversos procesos de muerte celular como apoptosis, necrosis y necroptosis. Sin embargo, la mayoría de los ensayos de citotoxicidad se miden al final del experimento, lo que dificulta estudiar la respuesta dinámica de las células a los fármacos.
En esta nota de aplicación, nuestro objetivo fue examinar el rendimiento de un ensayo de citotoxicidad utilizando imágenes en tiempo real. Las células tratadas con diversas concentraciones de Nocodazol, un fármaco anticancerígeno, fueron teñidas con un tinte fluorescente durante la muerte celular y luego monitoreadas con Celloger® Mini Plus. Se observó mediante imágenes en lapso de tiempo que la apoptosis aumentaba de manera dependiente de la dosis de Nocodazol, y el grado de apoptosis se midió cuantitativamente y se graficó usando el software Analysis proporcionado con el Celloger® Mini Plus.
Método
Las células HeLa se contaron usando Facscope B, un contador automático de células, y se sembraron a 1 x 104 células/pozo en una placa de 48 pozos. Después de cultivarlas durante la noche, las células se trataron con diversas concentraciones (16.625 nM, 31.25 nM, 62.5 nM, 125 nM, 250 nM) de Nocodazol. En este punto, se añadió a la muestra el tinte CellTox green (Promega, G8742), que se une al ADN de las células con integridad de membrana deteriorada durante la muerte celular. Usando el Celloger® Mini Plus instalado dentro de una incubadora, se adquirieron imágenes celulares cada 1 hora durante 48 horas y luego se analizaron con el software Analysis. La tasa de muerte celular (%) se calculó como cobertura de fluorescencia (= células muertas) ÷ confluencia en campo claro (= total de células).
Resultados
Como resultado del tratamiento de las células con nocodazol en diferentes concentraciones y su imagen a lo largo del tiempo, la morfología celular cambió de manera dependiente de la concentración y se observó una reducción de la confluencia en imágenes de campo claro (Figura 1A, B). Además, la imagen fluorescente de las células muertas teñidas con CellTox, midiendo su cobertura y cuantificando la muerte celular, mostró que la proporción de células fluorescentes aumenta con la apoptosis (Figura 1C).
Figura 1. Análisis de la muerte celular dependiente de la dosis de Nocodazol usando imágenes en lapso de tiempo
(A) Imágenes combinadas de campo claro y fluorescencia para cada concentración de Nocodazol.
Las imágenes se muestran en intervalos de 24 horas, y la fluorescencia verde indica las células muertas. (Barra de escala: 200 um)
(B) Gráfico de confluencia (%) del total de células a lo largo del tiempo.
(C) Gráfico de la tasa de muerte celular (%) a lo largo del tiempo.
Conclusión
Celloger® Mini Plus es un dispositivo de imagen celular en vivo que puede realizar simultáneamente imágenes de campo claro y fluorescencia dentro de una incubadora. El sistema cuenta con una cámara totalmente motorizada que permite la captura de imágenes en varias posiciones a intervalos programados por el usuario. El gráfico de confluencia a lo largo del tiempo se puede obtener calculando la confluencia de las imágenes capturadas mediante el software Analysis. Además, al medir la cobertura de fluorescencia, se puede cuantificar el grado de apoptosis según la concentración de Nocodazol.
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