NOTA DE APLICACIÓN: Uso de Celloger® Mini Plus para Observar Cambios Morfológicos y la Actividad Fagocítica en la Línea Celular de Macrófagos

Sistema Automatizado de Imagen Celular Viva Celloger® Mini Plus

Un sistema integrado de monitoreo celular en vivo para la imagen estable de células en suspensión en investigación inmunológica

Como las células blancas responsables de la función inmune son células en suspensión que viajan por los vasos sanguíneos, los estudios de inmunología suelen utilizar diversas líneas celulares en suspensión originadas de leucocitos. Trabajar con células en suspensión, a diferencia de las células adherentes, implica que un ligero movimiento de la placa al colocarla en el microscopio hace que las células floten. Aparte de los problemas causados por la inestabilidad de la temperatura y el CO₂, de hecho no es posible usar un microscopio tradicional para monitorear células en tiempo real. Por lo tanto, para monitorear células en suspensión de manera estable, es esencial un dispositivo de imagen celular en vivo como Celloger® Mini Plus que funcione dentro de una incubadora¹. Además, con Celloger® Mini Plus, la cámara dentro del sistema se mueve para capturar imágenes de las células en múltiples posiciones para mantener la muestra celular en un estado estable en lugar de tener un escenario móvil con una placa encima. Cuando se monitorearon células en suspensión tanto con Celloger® Mini Plus como con microscopio, la imagen con Celloger® Mini Plus fue más estable en comparación con el uso de un microscopio, en el que varias células estaban fuera de foco (Figura 1).

Figura 1. (Derecha) Ventajas de usar Celloger® Mini Plus durante la imagen de células en suspensión.

Para la imagen de células en suspensión usando un microscopio invertido, la fluctuación celular es inevitable ya que la muestra debe sacarse de la incubadora, colocarse en el escenario del microscopio y moverse para localizar otras posiciones dentro de la placa. En este proceso, se observa que muchas células flotan y están fuera de foco (imagen izquierda). Por otro lado, la imagen con Celloger® Mini Plus permite que todo el proceso de imagen se realice dentro de la incubadora. La placa está firmemente fijada en el dispositivo y se pueden capturar imágenes en múltiples posiciones dentro de la placa moviendo la cámara dentro del sistema; por lo tanto, nada provoca que las células floten y no se observan células fuera de foco (imagen derecha).

Los leucocitos, como parte del sistema inmunológico, combaten infecciones y defienden el cuerpo contra materiales extraños. Un sistema de primera línea de defensa conocido como inmunidad innata genera respuestas inflamatorias rápidas para prevenir inmediatamente la propagación y el movimiento de patógenos extraños por todo el cuerpo. Debido a que la activación del sistema inmunitario innato se inicia en pocas horas y genera respuestas inflamatorias rápidas, es importante monitorear en tiempo real las diversas defensas celulares que ocurren en este proceso. Una función importante de la inmunidad innata es el reclutamiento rápido de células inmunitarias al área infectada. Entre los leucocitos, los monocitos infiltran tejidos y se diferencian en macrófagos, mientras inducen una respuesta inmune contra patógenos invasores mediante fagocitosis. Realizamos imagen celular en vivo con Celloger® Mini Plus (canales de campo claro y fluorescencia verde, objetivo 10X) usando la línea celular Raw264.7, que representa las características funcionales del macrófago y es bien conocida por los cambios causados por lipopolisacárido (LPS)².

Cuando las células Raw264.7 fueron estimuladas con LPS, aumentaron las células diferenciadas. A medida que las células redondas y cuboidales gruesas en un estado de adhesión débil se diferenciaron, se extendieron lentamente y se adhirieron más firmemente en forma de huso, y esto se observó a través de imágenes tomadas cada 15 minutos por Celloger® Mini Plus (óptica 10X).

Según el estudio de Saxena et al. (2003), las células Raw264.7 estimuladas con LPS se diferencian en células similares a dendríticas³. Confirmamos mediante monitoreo en tiempo real usando EVOM™AutoLCI que las células se adhirieron más firmemente y se volvieron más anchas y planas que las células sin tratamiento con LPS (Figura 2).

Figura 2. Monitoreo de cambios morfológicos en células Raw264.7 con LPS

Este cambio en la morfología fue más visible 11 horas después del tratamiento con LPS y duró hasta 22 horas. Además, la estimulación con LPS resultó en proliferación celular, que se cuantificó mediante la función de análisis de confluencia de Celloger® Mini Plus (Figura 3).

Figura 3. Curva de crecimiento de células estimuladas con LPS mediante análisis de confluencia

Usando las imágenes de lapso de tiempo (capturadas con Celloger® Mini Plus, óptica 10X) y analizando la confluencia celular con la aplicación de análisis AutoLCI, se puede obtener un gráfico de crecimiento celular.

Existe un informe que indica que la activación inducida por LPS de macrófagos aumenta la fagocitosis a través de la vía dependiente del receptor tipo toll 4^2,4. Para confirmar esto en tiempo real, realizamos imágenes de fluorescencia usando perlas de látex fluorescentes que fueron engullidas por los macrófagos. Las perlas fluorescentes de 2 µm de tamaño se movían fácilmente con el más mínimo movimiento y flotaban sobre la placa. Esto no solo disminuye la eficiencia de captación de perlas por las células, sino que también puede dificultar la imagen. De hecho, incluso los kits comerciales de ensayo de fagocitosis recomiendan contar solo las células que han engullido perlas mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo después de un lavado adecuado al final para eliminar las perlas no engullidas^5,6. En este experimento, la imagen en tiempo real de Celloger® Mini Plus mostró todo el proceso de fagocitosis de las perlas por las células y la captación de perlas que ocurre solo en las células activadas que se extendieron planas con la estimulación de LPS (Figura 4A).

Figura 4. Fagocitosis de células Raw264.7 estimuladas con LPS observada con Celloger® Mini Plus (campo claro y canal de fluorescencia verde, óptica 10X)

Se espera que el comportamiento de estas células activadas sea posible porque se mueven eficientemente hacia las perlas en forma de huso, lo que provoca migración direccional en comparación con la forma redonda y cúbica antes de la diferenciación. También se observó en tiempo real que las perlas se dividían en células hijas junto con el citoplasma cuando las células se dividían después de la captación de perlas (Figura 4B).

Se observó que las células Raw264.7 activadas tras la estimulación con LPS engulleron la perla fluorescente. Se tomaron imágenes de lapso de tiempo con intervalos de 15 minutos para observar la migración de las células hacia la perla y la captación de la misma.
Las perlas engullidas dentro de las células se dividen en células hijas junto con el citoplasma durante la mitosis.

Además, es posible obtener información sobre procesos dinámicos en diversos entornos moleculares utilizando las características únicas de la sonda fluorescente. Si un tinte fluorescente puede ser imagen adicionalmente junto con la imagen de campo claro, puede usarse para estudios más profundos. Usando un tinte de ácidos nucleicos impermeable a la célula, se puede evaluar la citotoxicidad mediante el aumento de la permeabilidad del tinte debido al daño de la membrana durante la apoptosis⁷. Y en el caso particular de los neutrófilos, la formación de NET también puede detectarse mediante tinción de ácidos nucleicos⁸. Además, es posible cuantificar la generación de especies reactivas de oxígeno⁹ en células usando tintes que reaccionan con estas especies o observar la acidificación intracelular en el proceso de endocitosis y fagocitosis usando un tinte sensible al pH¹⁰.

La imagen celular en vivo con Celloger® Mini Plus permite obtener imágenes de alta resolución de las células mientras elimina perturbaciones físicas como daño celular o vibraciones. Es un sistema automatizado que funciona perfectamente dentro de una incubadora, eliminando la necesidad de mover el dispositivo dentro y fuera de la incubadora. A diferencia de otros dispositivos, Celloger® Mini Plus no tiene un escenario móvil, sino que la cámara dentro del sistema se mueve para capturar imágenes de las células en múltiples posiciones. Dado que el recipiente y las muestras celulares están en un estado estable, esto proporciona un ambiente estable para el crecimiento celular y aumenta la tasa de éxito en investigaciones basadas en células. El sistema es compatible con varios tipos de recipientes de cultivo y tiene alta reproducibilidad de posición para un rendimiento estable durante la imagen multipunto; por lo tanto, Celloger® Mini Plus ofrecerá resultados confiables en la investigación inmunológica.

Referencias

Awasthi, Bhuwan Prasad, et al. (2021) Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry
Wu, Tsu-Tuan et al. (2009) Toxicology letters vol.
Saxena, Rajiv K et al. (2003) Journal of biosciences vol.
Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one
Ariganello, Marianne B., et al. (2018) International journal of nanomedicine
Manda-Handzlik, Aneta, et al. (2018) Immunology and Cell Biology
Riss, Terry, et al. (2019) Assay Guidance Manual [internet]
Takishita, Yutaka, et al. (2019) Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition
Pal, Kunal, et al. (2019) Materials Science and Engineering: C
Diwu, Zhenjun, et al. (1999) Chemistry & biology