Detección de Ca2+ en tejido muscular mediante espectroscopía de fluorescencia
El uso de sondas fluorescentes en la fisiología celular se ha convertido en una herramienta indispensable en el análisis del funcionamiento celular en los últimos años. La física subyacente a la fluorescencia se ilustra mediante el diagrama de estados electrónicos (llamado diagrama de Jablonski, ver Fig. 1), que muestra el proceso de tres etapas para crear la señal fluorescente (Excitación - Estado Excitado/Duración del Estado - Emisión de Fluorescencia) en un fluoróforo/indicador y se describe de forma simplificada a continuación.
Fig. 1– Diagrama de Jablonski que ilustra los procesos de fluorescencia mediante la absorción de fotones de mayor energía por un fluoróforo y la posterior emisión de fotones de menor energía, resultando en fluorescencia durante la duración de la fluorescencia.
La fluorescencia se obtiene cuando un fotón de excitación (hνEX) de una fuente externa, como un LED de alta potencia, es absorbido por un fluoróforo que eleva su energía (S1’). Durante la duración de la fluorescencia, la energía elevada (S1’) decae a un estado de energía más bajo S1. Luego, la fluorescencia resulta en la emisión de un fotón con menor energía (hνEM) y por lo tanto de longitud de onda más larga. Fundamental en espectroscopía es la diferencia de energía o longitud de onda representada por (hνEX-hνEM), que se llama desplazamiento de Stokes. El desplazamiento de Stokes permite una discriminación eficiente de la excitación, haciendo de la fluorescencia una técnica muy sensible y capaz de ser detectada contra un fondo bajo, aislada de los fotones de excitación.
Fig. 2– Diagrama típico de excitación-emisión, mostrando el espectro de absorción de una molécula a longitud de onda más corta (es decir, mayor energía) de una fuente de excitación correspondiente y el espectro de fluorescencia resultante de la luz emitida a longitud de onda más larga (es decir, estado de menor energía).
Se pueden identificar entonces cuatro elementos esenciales de la señalización por fluorescencia para construir un sistema de detección:
- Fuente de luz de excitación adaptada a la banda de absorción del fluoróforo (por ejemplo, LED de alta potencia de longitud de onda específica)
- Un fluoróforo/indicador (por ejemplo, Fura-8 para la detección de Ca2+ libre en tejido muscular)
- Filtros de longitud de onda de emisión para limitar la banda de los fotones emitidos o bandas superpuestas
- Un sistema detector que registre la luz fluorescente y produzca una salida registrable como señal eléctrica (por ejemplo, tubos fotomultiplicadores).
Independientemente de la aplicación, la compatibilidad de estos cuatro elementos es esencial para optimizar la detección de fluorescencia.
Ejemplo de detección de Ca2+ libre en tejido muscular
Típicamente, se introduce un tinte fluorescente en el tejido o células individuales para obtener una respuesta fluorescente de la molécula marcada. Un ejemplo típico es la detección del aumento transitorio en la concentración de calcio libre citoplasmático/miosplasmático (Δ[Ca2+]) como evento intermedio de señalización del acoplamiento excitación-contracción. La cuantificación de Δ[Ca2+] se realiza usando una luz monocromática para excitar la molécula marcada con tinte de Ca2+ en una muestra de tejido/célula, ya sea en un baño de tejido o en un montaje experimental microscópico. La señal fluorescente emitida por el tinte indicador puede usarse para monitorear la amplitud y el curso temporal del Δ[Ca2+] detectado por detectores sensibles, como tubos fotomultiplicadores altamente sensibles (módulo PMT) o cámaras.
El tinte indicador ratiométrico Fura-8™ es muy adecuado para la detección de transitorios de Δ[Ca2+]. Fura-8™ se excita a longitudes de onda de 365 nm y 410 nm y la emisión se registra a 525 nm en modo de doble excitación/única emisión, es decir, medición ratiométrica. Las ventajas de elegir esta técnica de medición ratiométrica son:
- La minimización de artefactos por movimiento
- Cancelación de posibles efectos de carga desigual
- Distribución inhomogénea del indicador fluorescente en las células
- Decoloración del tinte indicador en la detección de transitorios de Δ[Ca2+] en tejido muscular.
Esto permitió la cuantificación y comparación entre:
- Técnicas de alta resolución espacial frente a alta resolución temporal en cortes del ventrículo izquierdo humano
- La posibilidad de medir transitorios de concentración de calcio libre (Δ[Ca2+]) en un baño de tejido horizontal en cortes del ventrículo izquierdo humano o cortes murinos.
Fig. 3– Representación cualitativa de algunos resultados de detección de Ca2+ libre en cortes de corazón humano usando el sistema SI-BF-100.
Intensidades promedio de fluorescencia de cortes del ventrículo izquierdo humano cargados con Fura-8 detectadas a 525 nm, cuando se excitan a 340 nm y 410 nm, respectivamente, y ratios calculados (traza inferior) a partir de los datos de imagen de una cámara Rolera EM-C2 (izquierda). A la derecha, la respuesta del SI-BF-100 detectada usando dos configuraciones de apertura y ratios calculados (trazas inferiores). Además, se muestran datos fluorescentes recogidos con la configuración de apertura pequeña y filtrados con paso bajo a 50 Hz. Note la gran diferencia temporal en la detección de la señal fluorescente entre los datos de imagen (Rolera EM-C2) y la detección SI-BF-100 (intervalo de 210 ms vs. 1 ms), permitiendo la detección de transitorios de Ca2+ que cambian rápidamente (de Belz et al., cartas SPIE, 2016).
Referencias
Belz M., et. al. Biofluorómetro de fibra óptica para investigación fisiológica en cortes musculares. Proc. SPIE 9702, Fibras Ópticas y Sensores para Diagnóstico Médico y Aplicaciones de Tratamiento XVI, 2016.
Espectrofotometría. Wikipedia, la enciclopedia libre, 2017 (Referencias cruzadas).
