自動化と最適化

ヒト一次アストロサイト（iXCells 10HU-035）は、10%ウシ胎児血清（FBS; 35-010-CV）を添加したDulbecco改変イーグル培地（DMEM; 10-013-CM）で解凍され、Corning® BioCoat® コラーゲンIコートフラスコ（354486）上で培養されました。凍結保存された作業用バンク細胞は、解凍後または新しいコラーゲンコートフラスコへの一回の継代後に使用されました。神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Y（ATCC®; CRL-2266）は、10% FBSを添加したDMEMで培養されました。hCMEC/D3（MilliporeSigma; SCC066）は、Corning® BioCoat® コラーゲンIコートフラスコ上で、EBM-2（Lonza; 3156）にEGM-2 MV（Lonza; 4147）、さらに2.5% FBSおよび1%化学修飾脂質濃縮液（Thermo Scientific; 11905031）を添加した培地で培養されました。

0.4 μmのCorning® HTS Transwell®-24ウェル透過性サポート（3379）を使用して、単一、二重、三重の培養のさまざまな組み合わせが設定されました。アストロサイトを培養したインサートには、リン酸緩衝生理食塩水（PBS; 21-040-CM）で希釈した100 μg/mLのCorning® Matrigel® 成長因子低減基底膜マトリックスの50 μLの滴を、プレートを蓋に逆さにしてインサートの裏面に塗布しました。インサートはラミナーフローフード内で1時間インキュベートした後、吸引し、アストロサイトを播種しました。アストロサイトはAccutase® 細胞剥離液（25-058-CI）で収穫し、10% FBSを含むDMEMに264,000細胞/mLの密度で再懸濁しました。細胞の50 μLの滴（75,000細胞/cm2）を逆さにした各インサートに加え、細胞が付着するまで1時間置いた後、プレートを通常の培養位置に戻し、インサートに200 μL、受け皿ウェルに500 μLの10% FBS含有DMEMを満たしました。同じ日に、SH-SY5Yを含む受け皿プレート（3524）には、Accutase®で収穫した細胞を10,000細胞/cm2の密度で500 μLの10% FBS含有DMEM中に播種しました。アストロサイトおよびSH-SY5Yの培養は、hCMEC/D3添加前に約72時間別々にインキュベートしました。hCMEC/D3はAccutaseで収穫し、アストロサイトの有無にかかわらず、40,000細胞/cm2の密度で300 μLのhCMEC/D3アッセイ培地中にインサートに播種しました。hCMEC/D3アッセイ培地は、牛脳抽出物を除いたEBM-2にEGM（Lonza; 4133）を補足し、さらに3%のFBSと1%の化学修飾脂質濃縮液を加えたものです。インサートは、SH-SY5Y細胞の有無にかかわらず、下の細胞培養プレートに1 mLのhCMEC/D3アッセイ培地を入れて組み合わせました。培地は隔日で交換しました。hCMEC/D3添加後48時間で、一部の培養はCorning® LSE™ 低速軌道シェーカー（6780-FP）を50 RPMに設定して剪断条件に曝されました。TEERはhCMEC/D3細胞添加後、World Precision Instruments EVOM™ AUTO（EVA-MT-03-02）を使用して毎日測定しました。

24のHTS単層培養は、培地を吸引して除去し、各インサートに500μLの4％パラホルムアルデヒド（PFA；Boston BioProducts；BM-155）を加え、細胞培養プレートには1mLを加えて固定しました。室温で15分間反応させた後、同量のPBSでインサートを洗浄しました。次に、単層培養を0.1％トリトンX（Integra Chemical Company；T756.30.30）で15分間透過処理し、再度PBSで洗浄しました。その後、単層培養を2～8ºCで一晩、PBS中の2％ウシ血清アルブミン（MilliporeSigma；A9576）でブロックしました。翌日、細胞をPBSで洗浄し、単層培養を100μLの1:1000希釈のZO-1抗体（Invitrogen；740002MP647）で2～8ºCで一晩染色しました。

Corning® HTS Transwell® 24ウェル透過性サポートでの最適化後、同じプロトコルを0.4 μm Corning® HTS Transwell® 96ウェル透過性サポート（7369）に適用し、AstrocyteとhCMEMC/D3、SH-SY-5YとhCMEMC/D3の条件のみを使用しました。マトリゲルコーティングとインサートの裏面へのAstrocyteの播種量は各インサートあたり22 μLに減らし、μgまたは細胞数をcm2あたり同じに保つよう濃度を調整しました。Astrocyteの細胞付着後、各インサートに100 μLの10% FBS含有DMEMを加え、受け皿ウェルには200 μLを加えました。さらに、SH-SY-5Y細胞はCorning HTS Transwell-96受け皿プレート（3382）に各ウェル200 μLで播種しました。hCMEC/D3の付着から48時間後にすべてのインサートにせん断力を加えました。TEERはEVA-MT-03-01電極アレイを用いて毎日測定しました。

hCMEC/D3を添加してから約120時間後、Corning® HTS Transwell® 96パーミアブルサポートから培地を吸引し、段階希釈したリポポリサッカライド（LPS；Invitrogen；00-4976-93）、インスリン（Thermo Scientific；12585014）、TNFアルファ（Thermo Scientific；300-01A-500 μg）またはネガティブコントロールとして培地に置き換えました。化合物はシェーカー上で培養物とともに48時間インキュベートされ、TEERは毎日測定されました。

図1：せん断応力はBBBのバリアの完全性を高める。A. 重力によるせん断応力がない状態でトランスウェルプレート上に細胞を5日間静置培養した場合、hCMEC/D3細胞は単独培養またはアストロサイトおよび/または神経芽細胞腫細胞（SH-SY5Y）と組み合わせて培養した場合に、アストロサイトよりも高いTEER値を示します。B.

TEERは、バリアの完全性を非破壊的に機能的に評価する分析技術であり、2Dおよび3D組織モデルの変化をモニターし、in vitroおよびin vivoの現象を相関させることができます。

図2：ZO-1免疫組織化学は、せん断応力下でのhCMEC/D3細胞のタイトジャンクションおよび血液脳関門（BBB）完全性の増加を示しています。透過性支持体上で静置培養（上段）またはせん断条件下培養（下段）されたさまざまな細胞組み合わせの代表的な画像。培養は8日目に固定。画像はLeica Stellaris 5レーザー走査共焦点顕微鏡、40倍/1.3 NA油浸対物レンズで撮影。スケールは20μmです。

図3：96ウェルHTSプレートで培養されたBBBモデルは、5日間のTEER測定によりバリアの完全性が向上し、透過性が低下することを示しています。実験ごとに3つの技術的複製および3つの独立した実験から得られた平均TEER測定値で、細胞のないトランスウェル（培地のみ）の背景値を差し引いています。データは標準誤差とともに示されています。統計解析では、非対応両側t検定によりp<0.05が*で示されています。図4：LPSはBBBの透過性を増加させます。LPSの影響。48時間にわたり増加するLPS濃度に曝露した培養物の平均TEER測定値。データは実験ごとに3つの技術的複製および3つの独立した実験の平均で、標準誤差とともに示されています。培地のみと比較したDunnettの事後検定を伴うANOVA。*=p<0.05、**=p<0.005、***=p<0.001、****=p<0.0001。インスリンの影響。48時間にわたり増加するインスリン濃度に曝露した培養物の平均TEER測定値。データは実験ごとに3つの技術的複製および3つの独立した実験の平均で、標準誤差とともに示されています。培地のみと比較したDunnettの事後検定を伴うANOVA。*=p<0.05、**=p<0.005、***=p<0.001、****=p<0.0001。TNF-αの影響。48時間にわたり増加するTNF-α濃度に曝露した培養物の平均TEER測定値。データは実験ごとに3つの技術的複製および3つの独立した実験の平均で、標準誤差とともに示されています。培地のみと比較したDunnettの事後検定を伴うANOVA。*=p<0.05、**=p<0.005、***=p<0.001、****=p<0.0001。

低速のオービタルシェーカーを使用してせん断力を加えたり、一次アストロサイトやSH-SY5Yなどの追加のBBB関連細胞タイプを加えたりすることで、静置培養のhCMEC/D3バリアと比較してTEER値が統計的に増加することがあります。

免疫細胞化学染色により、せん断条件下で培養されたhCMEC/D3細胞がより直線的に整列している様子が示されました。

EVOM™ Autoは、Corning Transwellの24ウェルおよび96ウェル透過性サポート上で培養された内皮単層のTEER測定を迅速かつ再現性高く自動化します。無菌かつ非破壊的にバリアの完全性をモニタリングできるため、研究者は長期的かつ縦断的な研究において、リアルタイムでの透過性測定としてTEERを効率的に活用でき、コストと変動を削減できます。

EVOM AutoとCorning Transwell透過性サポートの組み合わせにより、バリアモデルの最適化が簡単に行え、より高スループットのアッセイが可能になります。