TEER測定の問題をトラブルシューティングする方法
シュブラ・ナグ博士 著
経上皮/経内皮電気抵抗（TEER）測定は、細胞の密着度、バリアの完全性、または多孔プレート上で培養された細胞単層のバリア機能など、細胞の健康状態を評価するために最も広く用いられている手法の一つです。WPIのエピセリアル・ボルトオームメーター（EVOM）を用いたTEER測定は、その信頼性の高い測定結果と多様な細胞種での豊富な文献引用により、ゴールドスタンダードとされています。EVOM™マニュアルおよびEVOM™オートは、さまざまな電極（STX4、STX HTSハイスループットスクリーニング、EndOhmチャンバー、およびEVOM™オート用のマルチ電極アレイ）と組み合わせて、6、12、24の取り外し可能なインサートおよび24、96ウェルのハイスループットプレートフォーマットで細胞サンプルの測定と解析を可能にします。TEER測定を行う際に研究者が直面しやすい主な課題は以下の通りです：
- 不安定な測定値
- 測定範囲外の値
- サンプルの複製間やバッチ間での測定の不一致
TEER測定の問題を克服し、正確で信頼性の高い測定を得るために、以下の要因を考慮してください：
サンプル中の導電性液体の存在
安定した測定を得るためには、電極の先端（活性センシング領域）が1XPBSバッファーや細胞培養培地などの導電性液体に浸っている必要があります。脱イオン水は使用できません。EVOMの印加電流がサンプルを通過するためには、溶液中にイオン（例：塩化物イオン）が存在している必要があります。イオン濃度と測定される電気抵抗値は逆相関の関係にあります。イオン強度や濃度が増加すると、抵抗値は逆に減少します。安定かつ一貫した測定を行い、意味のある比較をするために、すべてのサンプルで同じ培地またはバッファー溶液を使用してください。
適切な液体量
マルチウェルまたは細胞培養インサートの膜の上側（頂端側）と下側（基底側）にある液体の量は、電極の先端が導電性溶液に完全に浸るのに十分でなければなりません。液体量が不足すると、電極がサンプル間で安定して電流を通すことができず、不安定な読み取り値や測定範囲外の値が生じる可能性があります。細胞培養インサートの膜が破損している場合、頂端側の液体が基底側に容易に移動します。このようなサンプルは、電流が液体の漏れ経路を通って流れるため、正確な電気抵抗の推定ができず、研究から除外すべきです。安定した読み取り値を得るために、液体量は一貫して使用してください。
インサート/プレートタイプに合った電極の選択
WPIは、一般的に使用される細胞培養インサート（例：Corning、Millipore、MatTek、Greiner）に対応したさまざまな寸法と形状の電極を提供しており、6、12、24、96ウェルのサイズに対応しています。WPIは、最良の結果を得るために、細胞培養インサートまたはマルチウェルタイプに合った電極の使用を推奨しています。例えば、Corning 3460の12ウェルインサートには、ENDOHM-12（EVOM2用パーツ番号ENDOHM-12G、EVOM™マニュアル用パーツ番号EVM-EL-03-01-02）を使用する必要があります。適合しない電極で得られたデータは大幅に不正確になる可能性があります。
サンプル上の電極の位置
電極の位置（サンプル内への深さを含む）は、生の抵抗値の読み取りに影響を与えることがあります。電極の配置を一定に保つことで、印加電流がサンプルを通過する経路が固定され、電気抵抗の読み取り値の変動を排除または最小化できます。WPIの高度な電極であるENDOHMやSTX HTSは、適切に対応するマルチウェルと組み合わせて使用することで、電極位置の一貫性により読み取りのばらつきを最小限に抑えます。EVOM™オートを使用する場合、自動ロボットアームによる動作により、同じ電極アレイ/プレートプロファイル設定を一貫して使用する限り、この影響は排除されます。
ブランクの使用とブランク差し引き
「ブランクサンプル」とは、細胞を含まない細胞培養インサートまたはマルチウェルで、同じ実験条件（同じ液体の種類と量を含む）に準拠したものを指します。サンプルの抵抗値からブランクの抵抗値を差し引いてTEER値を計算することで、電極位置、サンプル液体の種類や量などの変動要因の影響を最小化できます。EVOM™マニュアルおよびEVOM™オートの両システムは、ブランク値を保存し、サンプル抵抗値から自動的に差し引く機能を備えています。
安定した温度でのサンプル測定
WPIは、測定前にプレートをインキュベーターから取り出し、細胞培養用ラミナーフード内で室温に20分間順応させることを推奨しています。37℃のインキュベーターから直ちに取り出して測定すると、サンプル間で大きな温度差が生じる可能性があり、例えばサンプル1は37℃であるのに対し、同じプレートのサンプル12は32℃である場合があります。同様に、測定前に液体を追加する場合は、室温に順応させた培地や溶液を使用してください。温度はタイトジャンクションの透過性に影響を与え、TEERの読み取り値に影響を及ぼすことが知られています。したがって、安定した読み取り値を得るためには、安定した温度で測定を行う必要があります。
電極の清掃とメンテナンス
電極の定期的かつ日常的な清掃とメンテナンスは、電極の機能寿命を保つために非常に重要です。電極は使用後または一日の終わりにすぐに清掃しないと、培地やバッファーからの塩分やタンパク質の沈着物が蓄積しやすくなります。この沈着物は電極の活性センシング領域を塞ぎ、低抵抗値や不安定な読み取り値の原因となります。WPIは、使用後や一日の終わりに電極を定期的に清掃し、センシング領域に沈着物が形成されないようにすることを推奨しています。
電極の先端は通常、エタノールまたはイソプロパノールで洗浄し、その後脱イオン水でリンスします。電極の先端は自然乾燥させ、乾燥した状態で保管してください。タンパク質の沈着を防ぐために、EnzolやAlconoxなどのプロテアーゼ系洗剤を用いた定期的な洗浄も推奨されます。活性センシング領域以外の電極部分は液体に浸すことができないため、アルコールをスプレーしたペーパータオルで拭いてください。電極の先端やセンシング領域は、3～6％の次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）に10分間浸し、その後脱イオン水でリンスすることで塩化銀を補充し、電極の適切な機能と安定した読み取りを維持できます。詳細は各電極の取扱説明書の清掃およびメンテナンスのセクションを参照してください。
上記の提案に従ってTEER測定実験を行うことで、TEER測定の問題を克服し、安定かつ再現性のある結果を得ることが期待できます。ご質問がある場合は、(866) 606-1974までお電話いただくか、wpi@wpiinc.comまでメールでお問い合わせください。
