蛍光分光法を用いた筋組織のCa2+検出

細胞生理学における蛍光プローブの使用は、近年、細胞機能の解析に不可欠なツールとして重要性を増しています。蛍光の物理学的基礎は、電子状態図（いわゆるジャブロンスキー図、図1参照）によって示されており、蛍光色素/指示薬における蛍光信号を生成する3段階のプロセス（励起 - 励起状態寿命 - 蛍光放出）を以下に簡単に説明しています。

ジャブロンスキー図

図1 – 蛍光色素による高エネルギー光子の吸収とその後の低エネルギー光子の放出によって蛍光寿命中に蛍光が生じる過程を示すジャブロンスキー図。

蛍光は、外部光源（例えば高出力LED）からの励起光子（hν_EX）が蛍光色素に吸収され、そのエネルギーが高められる（S1’）ことで得られます。蛍光寿命の間に、高められたエネルギー状態（S1’）はより低いエネルギー状態S1に減衰します。その後、蛍光はより低いエネルギー（hν_EM）の光子を放出し、したがって波長が長くなります。分光学の基本は、(hν_EX-hν_EM)で表されるエネルギーまたは波長の差であり、これをストークスシフトと呼びます。ストークスシフトにより励起光を効率的に区別できるため、蛍光は非常に感度の高い技術となり、励起光子から分離された低いバックグラウンドの中で検出可能です。

ストークスシフト

図2 – 典型的な励起-蛍光放出図。分子の吸収スペクトルは短波長（すなわち高エネルギー）で励起光源に対応し、放出される光の蛍光スペクトルは長波長（すなわち低エネルギー状態）で示されます。

蛍光信号検出システムを構築するために特定できる4つの基本要素：

蛍光色素の吸収帯域に適合した励起光源（例：特定波長の高出力LED）
蛍光色素/指示薬（例：筋組織中の遊離[Ca²⁺]検出用のFura-8）
放出光子の帯域や重複帯域を制限するための放出波長フィルター
蛍光光を検出し、電気信号として記録可能な出力を生成する検出システム（例：光電子増倍管）

用途にかかわらず、これら4つの要素の互換性は蛍光検出の最適化に不可欠です。

筋組織における遊離Ca²⁺検出の例

通常、蛍光色素は組織や単一細胞に導入され、標識された分子の蛍光応答を得ます。典型的な例は、興奮収縮連関の中間シグナルイベントとしての細胞質/筋原線維質中の遊離カルシウム濃度の一過性増加（Δ[Ca²⁺]）の検出です。Δ[Ca²⁺]の定量は、組織浴または顕微鏡実験セットアップ内の組織/細胞サンプル中の蛍光色素標識Ca²⁺分子を単色光で励起して行います。指示薬の蛍光信号は、高感度光電子増倍管（PMTモジュール）やカメラなどの高感度検出器によって検出され、Δ[Ca²⁺]の振幅と時間経過をモニターするために使用されます。

ラティオメトリック指示薬染料Fura-8™はΔ[Ca²⁺]一過性変動の検出に適しています。Fura-8™は365 nmおよび410 nmの波長で励起され、525 nmの波長で放出が記録される二重励起/単一放出モード、すなわちラティオメトリック測定で使用されます。このラティオメトリック測定技術を選択する利点は以下の通りです：

動きによるアーティファクトの最小化
不均一な染料負荷の影響の打ち消し
細胞内での蛍光指示薬の不均一分布の補正
筋組織におけるΔ[Ca²⁺]一過性変動検出時の指示薬染料の退色防止

これにより、以下の定量化と比較が可能となりました：

ヒト左心室スライスにおける高空間分解能と高時間分解能技術の比較
ヒト左心室スライスまたはマウススライスの水平組織浴での遊離カルシウム濃度（Δ[Ca²⁺]）一過性変動の測定可能性

図3 – SI-BF-100システムを用いたヒト心臓スライスにおける遊離Ca²⁺検出の定性的表現。

340 nmおよび410 nmで励起された際に525 nmで検出されたFura-8染色ヒト左心室スライスの平均蛍光強度と、Rolera EM-C²カメラのイメージングデータから計算された比率（下部トレース）（左）。右は、2つの絞り設定で検出されたSI-BF-100の応答と計算された比率（下部トレース）。さらに、小絞り設定で収集され50 Hzでローパスフィルター処理された蛍光データも示されています。イメージングデータ（Rolera EM-C²）とSI-BF-100検出間の蛍光信号検出の大きな時間差（210 ms対1 msの間隔）に注目してください。これにより、急速に変化するCa²⁺一過性変動の検出が可能となっています（Belzら、SPIEレター、2016年より）。

参考文献

Belz M., et. al. 筋スライスの生理学的研究のためのファイバーオプティックバイオフルオロメーター。Proc. SPIE 9702, Optical Fibers and Sensors for Medical Diagnostics and Treatment Applications XVI, 2016.

分光光度法。ウィキペディア（フリー百科事典）、2017年（相互参照）。