Come risolvere i problemi di misurazione TEER
A cura di Subhra Nag, PhD
La misurazione della resistenza elettrica transepiteliale/transendoteliale (TEER) è una delle pratiche più utilizzate per valutare la salute cellulare, ad esempio la confluenza cellulare, l’integrità della barriera o la funzione di barriera dei monostrati cellulari cresciuti in piastre multiwell. La misurazione TEER con l’Epithelial Voltohmmeter (EVOM) di WPI è considerata il gold standard, grazie all’affidabilità delle misurazioni e ai numerosi riferimenti in letteratura ottenuti con diversi tipi di cellule. L’EVOM™ Manual e l’EVOM™ Auto, insieme alle diverse opzioni di elettrodi (STX4, STX HTS per lo screening ad alta processività, camere EndOhm e array multielettrodo per EVOM™ Auto), consentono ai ricercatori di analizzare campioni cellulari in inserti rimovibili da 6, 12 e 24 pozzetti e in piastre multiwell HTS da 24 e 96 pozzetti. Le principali difficoltà che si possono incontrare durante gli studi per misurare la TEER includono:
- Letture instabili
- Valori fuori scala
- Misurazioni incoerenti tra repliche o lotti di campioni.
Per risolvere eventuali problemi di misurazione della TEER e ottenere risultati accurati e affidabili, considerate i seguenti fattori:
Presenza di liquido conduttivo nei campioni
Per ottenere misurazioni stabili, le punte degli elettrodi (le aree di rilevamento attive) devono rimanere immerse in un liquido conduttivo, ad esempio tampone PBS 1X, terreno di coltura cellulare ecc. L’acqua deionizzata non è adatta. Affinché la corrente applicata dall’EVOM attraversi i campioni, la soluzione deve contenere ioni (ad esempio ioni cloruro). La concentrazione ionica e i valori di resistenza elettrica misurati sono inversamente proporzionali. All’aumentare della forza ionica o della concentrazione, il valore della resistenza dovrebbe diminuire in modo inversamente proporzionale. Per ottenere misurazioni stabili e coerenti e confronti significativi, utilizzate lo stesso terreno o la stessa soluzione tampone per tutti i campioni.
Volumi di liquido adeguati
I volumi di liquido sopra (apicale) e sotto (basolaterale) la membrana del multiwell o dell’inserto per colture cellulari devono essere adeguati, in modo che le punte degli elettrodi rimangano completamente immerse nella soluzione conduttiva. Un volume di liquido insufficiente può causare letture instabili o valori fuori scala, poiché l’elettrodo non riesce a far passare la corrente elettrica attraverso i campioni in modo costante. Se la membrana dell’inserto per colture cellulari è lacerata, il liquido apicale si sposterà facilmente verso il lato basolaterale. Questi campioni vanno esclusi dagli studi, poiché la corrente elettrica può passare attraverso il percorso di fuoriuscita del liquido campione, fornendo una stima imprecisa della resistenza elettrica. Utilizzate volumi di liquido uniformi per ottenere letture coerenti.
Scegliere un elettrodo adatto al tipo di inserto/piastra
WPI offre un’ampia gamma di elettrodi compatibili con dimensioni e geometria degli inserti per colture cellulari comunemente utilizzati (ad esempio Corning, Millipore, MatTek, Greiner) e disponibili in diversi formati (multiwell da 6, 12, 24 e 96 pozzetti). Per ottenere i migliori risultati, WPI consiglia di utilizzare un elettrodo compatibile con l’inserto per colture cellulari o il tipo di multiwell. Ad esempio, per gli inserti Corning 3460 a 12 pozzetti, è necessario utilizzare l’ENDOHM-12 (numero di parte ENDOHM-12G per EVOM2 o EVM-EL-03-01-02 per EVOM™ Manual). I dati ottenuti con un elettrodo non compatibile possono essere significativamente imprecisi.
Posizione dell’elettrodo sui campioni
La posizione dell’elettrodo (compresa la profondità di inserimento nei campioni) può influire sulle letture grezze della resistenza. Posizionare l’elettrodo in modo uniforme crea un percorso fisso e costante per il passaggio della corrente applicata attraverso i campioni ed elimina o riduce al minimo le variazioni delle letture della resistenza elettrica. Gli elettrodi avanzati di WPI, come ENDOHM o STX HTS, se utilizzati correttamente con i multiwell compatibili, riducono al minimo la variabilità delle letture grazie alla possibilità di mantenere costante la posizione dell’elettrodo. Con EVOM™ Auto, anche il movimento automatizzato del braccio robotico elimina questo effetto, purché si utilizzi sempre la stessa impostazione del profilo di array di elettrodi/piastra.
Uso di un bianco e sottrazione del bianco
Per “campione bianco” si intende un inserto per colture cellulari o un multiwell privo di cellule, sottoposto alle stesse condizioni sperimentali (inclusi tipo e volume del liquido). Sottrarre il valore di resistenza del bianco da quello del campione e quindi calcolare i valori TEER aiuta a ridurre al minimo gli effetti dei parametri variabili, come la posizione dell’elettrodo e il tipo e il volume del liquido campione. Entrambi i sistemi EVOM™ Manual ed EVOM™ Auto consentono di salvare i valori del bianco e di sottrarli automaticamente dai valori di resistenza dei campioni.
Misurare i campioni a temperatura stabile
WPI consiglia di estrarre le piastre dall’incubatore e lasciare acclimatare i campioni a temperatura ambiente all’interno della cappa a flusso laminare per colture cellulari per 20 minuti prima della misurazione. Se una piastra viene misurata subito dopo essere stata estratta da un incubatore a 37°C, si possono osservare grandi variazioni tra i campioni: il campione 1 potrebbe trovarsi a 37°C, mentre il campione 12 della stessa piastra potrebbe essere a 32°C. Analogamente, se prima della misurazione si aggiunge una soluzione, questa dovrebbe essere a temperatura ambiente. È noto che la temperatura influisce sulla permeabilità delle giunzioni serrate e può quindi influenzare le letture TEER. Per ottenere letture stabili, le misurazioni devono pertanto essere eseguite a temperatura costante.
Pulizia e manutenzione dell’elettrodo
La pulizia e la manutenzione regolari e quotidiane dell’elettrodo sono essenziali per garantirne la durata funzionale. Se non vengono puliti subito dopo l’uso o a fine giornata, sugli elettrodi tendono ad accumularsi depositi di sali e proteine provenienti dal terreno o dal tampone. Questi depositi possono ostruire l’area di rilevamento attiva dell’elettrodo e causare letture di resistenza basse o instabili. WPI consiglia di pulire regolarmente l’elettrodo al termine della giornata, dopo l’uso, per evitare la formazione di depositi sull’area di rilevamento.
Di norma, le punte degli elettrodi vengono lavate con etanolo o isopropanolo e poi risciacquate con acqua deionizzata. Lasciate asciugare le punte all’aria e conservate l’elettrodo in un luogo asciutto. Si consiglia di pulire periodicamente le punte degli elettrodi con detergenti proteolitici come Enzol o Alconox, per prevenire i depositi proteici. La parte dell’elettrodo diversa dalla punta con l’area di rilevamento attiva non deve essere immersa in alcun liquido e può essere pulita con un tovagliolo di carta imbevuto di alcol. Trattate periodicamente con cloruro le punte o l’area di rilevamento dell’elettrodo, immergendole per 10 minuti in ipoclorito di sodio al 3-6% (candeggina) e poi risciacquandole con acqua deionizzata. Questo trattamento è consigliato per reintegrare il cloruro d’argento e garantire il corretto funzionamento dell’elettrodo e letture stabili. Per ulteriori dettagli, consultate la sezione sulla pulizia e manutenzione nel manuale di istruzioni specifico dell’elettrodo.
Seguendo i suggerimenti sopra riportati per gli esperimenti di misurazione TEER, potrete risolvere i problemi di misurazione e ottenere risultati stabili e riproducibili. Per qualsiasi domanda, chiamateci al (866) 606-1974 oppure scriveteci all’indirizzo wpi@wpiinc.com.
