Domande frequenti sulla misurazione TEER

Ecco alcune domande frequenti (FAQ) sulla misurazione della TEER con un EVOM2.

A cura di Subhra Nag, PhD

La resistenza elettrica e la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) sono la stessa cosa?

No. Si ottiene il valore TEER moltiplicando il valore grezzo/ottenuto della resistenza misurata con un voltmetro epiteliale (come EVOM2) per l’area di crescita cellulare (ad es., l’area di un monostrato cellulare cresciuto su un inserto per colture cellulari).

Ad esempio, se si coltivano cellule su un inserto per colture cellulari con un’area di 0.5 cm².

La lettura della resistenza sul voltmetro epiteliale (ad es., EVOM2) indica un valore di 300 Ω.

TEER= 300 Ω × 0.5 cm² = 150 Ω- cm²

Che cos’è un EndOhm?

EndOhm è una camera progettata per EVOM2 , nella quale si inserisce un pozzetto rimovibile per effettuare le misurazioni della resistenza. Questa camera ha elettrodi in posizioni fisse; il loro posizionamento e la loro stabilità influiscono notevolmente sulla misurazione della resistenza dei tessuti.

Come si usa EVOM2 per misurare la confluenza?

EVOM2 si basa sul principio che, una volta misurato il pozzetto “bianco”, questa prima misurazione della resistenza comprende la somma della resistenza degli elettrodi, della distanza tra gli elettrodi e della resistenza dovuta al volume e alla molarità del mezzo liquido. (Le eventuali differenze di carica degli elettrodi vengono annullate dal metodo di misurazione di EVOM2', che inverte la polarità e calcola la media dei risultati.) Le successive misurazioni periodiche del pozzetto tracciano la crescita della membrana attraverso la misurazione della resistenza; quando il grafico della resistenza raggiunge un plateau, si può affermare che la membrana ha raggiunto la confluenza. Il sistema EVOM2 funziona proprio come un amplificatore a morsetto di tensione e un sistema Ussing, ma senza la speciale camera Ussing. Il sistema EVOM2 non è preciso quanto un sistema Ussing, ma il suo scopo è determinare se una membrana è confluenti, non eseguire analisi dettagliate. (Con il sistema EVOM2  si possono analizzare alcune proprietà di permeabilità della membrana, ma come variazione percentuale e non come valore assoluto della variazione.)

Perché usare un EndOhm invece di un STX?

EVOM2 rileva soprattutto i fori e le discontinuità nella membrana, poiché la corrente elettrica tende a seguire il percorso di minore resistenza. Gli elettrodi per uso generale STX2 possono flettersi e modificare la distanza tra gli elettrodi; inoltre, non tenerli fermi in un pozzetto può causare un errore significativo nella misurazione della resistenza. Gli elettrodi EndOhm , invece, sono fissati in posizione. Se sottoposti a una corretta manutenzione e pretrattati nel mezzo, forniscono letture della resistenza stabili, ripetibili e affidabili. Inoltre, gli elettrodi concentrici centrati assicurano che l’intera area della membrana sia esposta al flusso di corrente elettrica, evitando zone d’ombra dovute al posizionamento vicino al bordo, come può accadere con STX2. (Si noti che il valore TEER basale previsto del tessuto, se basso, può rendere più difficili le misurazioni su membrane di grandi dimensioni. Ad esempio: se il valore TEER è 200Ω-cm², in un pozzetto da 12 mm sarà 1.13 volte inferiore a parità di confluenza (176.9Ω). Lo stesso tessuto con valore di 200Ω in un pozzetto di 24 mm di diametro avrà un valore 4.52 volte inferiore, pari a 44.2Ω. Quando la resistenza scende al di sotto di circa 100Ω, si osserva una maggiore instabilità degli elettrodi e le letture possono variare. Abbiamo constatato che la “pulizia” e il precondizionamento degli elettrodi sono essenziali per ottenere letture stabili.)

Come si pulisce un elettrodo?

La pulizia degli elettrodi consiste nell’uso periodico di un detergente enzimatico (Enzol, Tergazyme) e/o in un ammollo in candeggina domestica non profumata (3% NaClO). La candeggina serve a rivestire nuovamente le superfici di Ag con AgCl e a dissolvere le proteine accumulate. Entrambi questi effetti causano instabilità degli elettrodi. Il detergente enzimatico è un agente sicuro per rimuovere i residui depositati sugli elettrodi dai componenti del mezzo, come DMEM. Se si lascia che si accumulino, la lettura della resistenza aumenta e può diventare instabile.

E per quanto riguarda il precondizionamento degli elettrodi?

Il precondizionamento degli elettrodi consiste nell’immergerli per un certo tempo nel mezzo di misurazione, per consentire a eventuali liquidi estranei di fuoriuscire dai pellet permeabili. Per sterilizzare questi elettrodi si usa comunemente l’alcol, che vi penetra e oppone un’elevata resistenza al flusso elettrico. Man mano che l’alcol viene lentamente sostituito all’interno dell’elettrodo da un mezzo a base salina, le letture della resistenza tendono a diminuire.  

Potete consigliarmi un semplice sistema di acquisizione dati per la TEER?

Lab-Trax-4 è un registratore di dati analogico-digitale silenzioso a 12 bit e quattro canali, con frequenze di campionamento fino a 10,000 campioni al secondo, oppure 2500 s/S per tutti e quattro i canali. L’unità è alimentata direttamente dalla porta USB2 e può essere usata sul campo con un laptop come dispositivo portatile. L’hardware dispone, se necessario, di quattro ingressi digitali e quattro uscite digitali.

Il software LabScribe3 è facile da usare e viene aggiornato frequentemente per soddisfare le esigenze più recenti. Man mano che Microsoft aggiorna i sistemi operativi, l’hardware continuerà a essere supportato dalle versioni più recenti di LabScribe. Ora è supportato anche sui computer Mac e Linux. Se si usa un STX2 per effettuare queste misurazioni, potrebbe servire un paio di mani in più per inserire il testo. Se si inserisce il testo nel campo Marks prima di effettuare le misurazioni, basterà premere Invio per inserire il contrassegno quando la lettura TEER si è stabilizzata. Se si usa un STX100, si avranno le mani libere per prendere appunti.

Quali difficoltà potrei incontrare durante la misurazione della TEER?

Questo testo è stato scritto per affrontare i problemi relativi a STX2, ma si applica anche a EndOhm.

Ognuno dei seguenti fattori può modificare la lettura della resistenza:

• Distanza tra gli elettrodi. Non allargare né comprimere la distanza tra gli elettrodi STX2.
• Resistenza degli elettrodi. Mantenere gli elettrodi puliti e condizionati.
• Profondità degli elettrodi. Immergere sempre gli elettrodi per almeno 2 mm.
• Elettrodi vicini alle pareti di plastica. Se possibile, tenere gli elettrodi lontani dalle pareti dei pozzetti.
• Posizionamento degli elettrodi. Se si appoggia abitualmente la gamba più lunga dell’elettrodo sul fondo del pozzetto, ripetere lo stesso posizionamento per garantire la coerenza.
• Resistenza del fluido. Non lasciare evaporare né diluire il mezzo.
• Livelli del fluido. Cercare di mantenere lo stesso volume di fluido per ogni lettura. Una piccola variazione può avere un effetto significativo in un inserto piccolo.
• Movimenti eccessivi. Cercare di tenere fermi gli elettrodi. In alcuni casi si può usare un supporto meccanico per gli elettrodi.
• Il lavaggio o il cambio del mezzo può causare una rottura della membrana dell’inserto per colture cellulari. Il cambio del fluido va eseguito con cautela, lungo la parete degli inserti. Una piccola area in cui il tessuto/strato cellulare si è sollevato dalla membrana dell’inserto per colture cellulari può creare un percorso diretto che consente a EVOM2 di rilevare una resistenza inferiore. La corrente attraversa questa fessura invece della membrana che contiene il monostrato cellulare, perché l’elettricità tende a seguire il percorso di minore resistenza. In questi casi, si noterà un drastico calo della resistenza. Quando si osserva una diminuzione così marcata del valore della resistenza, si consiglia di esaminare il campione (ad es., il monostrato cellulare su un inserto per colture cellulari) al microscopio per verificare la presenza di una rottura nel filtro o di un’ampia area vuota che indichi il distacco di un gruppo di cellule.

Effettuare più letture nello stesso pozzetto (3-5 volte) e calcolarne la media può ridurre la variabilità.

Potete suggerire alcuni parametri sperimentali controllabili per ottenere risultati TEER coerenti?

• È noto che la temperatura influisce sui valori TEER. Consigliamo di mantenere una temperatura costante per ottenere valori coerenti. Poiché le letture vengono effettuate nel mezzo/buffer di coltura cellulare, consigliamo di usare un bagno termostatico a temperatura fissa per riscaldare il mezzo/buffer da utilizzare durante l’esperimento. Una temperatura costante del mezzo/buffer garantisce condizioni sperimentali uniformi. Consigliamo di estrarre dall’incubatore la piastra con i pozzetti contenenti cellule cresciute su inserti di coltura e lasciarla a temperatura ambiente per almeno 20 minuti, in modo che la temperatura si stabilizzi prima di effettuare le misurazioni. 
• Se si usa una camera EndOhm, mantenere la stessa distanza fissa tra l’elettrodo superiore e quello inferiore per ottenere letture coerenti. Se si usa un elettrodo a bacchetta (STX2), cercare di tenerlo in posizione verticale durante la misurazione. Mantenere la stessa posizione degli elettrodi a bacchetta durante tutto l’esperimento dovrebbe consentire di ottenere letture coerenti.
• Consigliamo di usare lo stesso fluido con la stessa concentrazione ionica sia sul lato apicale (ad es., nella parte superiore di un inserto per colture cellulari) sia sul lato basolaterale (ad es., nella parte inferiore dell’inserto per colture cellulari, collocato in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti). Durante la misurazione, se si usa buffer PBS 1X sul lato apicale, consigliamo di usare buffer PBS 1X anche sul lato basolaterale. Consigliamo inoltre di mantenere allo stesso livello entrambi i fluidi (all’interno e all’esterno degli inserti per colture cellulari) per ridurre al minimo le differenze di pressione. Durante gli esperimenti, riempire prima il pozzetto/lato apicale per evitare che la pressione idrostatica stacchi la membrana dal filtro.
• Usare volumi costanti di fluido (mezzo/buffer) in tutti gli esperimenti riduce la variabilità dei dati.

Per ulteriori informazioni, vedere Registrazione delle misurazioni TEER con un EVOM2.

NOTA: EVOM2 è stato sostituito da EVOM™ Manual e il sistema Ussing è stato dismesso.