Pourquoi l'épaisseur de la lamelle est importante en microscopie
Regardez n’importe quel objectif de microscope plan achromatique et vous verrez « 0,17 » imprimé sur le tube. Cela fait référence à l’épaisseur de la lamelle en millimètres, la spécification du substrat pour laquelle l’objectif a été conçu. Lorsque cette spécification n’est pas respectée, la qualité de l’image en souffre. Voici ce que ce chiffre signifie, pourquoi il existe et ce qui se passe lorsqu’on l’ignore.
Le numéro sur le tube de votre objectif
Les objectifs de microscope plan achromatiques sont conçus autour d’un ensemble de paramètres optiques précis, notamment le grossissement latéral, le milieu d’immersion (si nécessaire), l’ouverture numérique, l’épaisseur de la lamelle (normalisée par l’industrie à 0,17 mm/170 µm) et parfois la distance de travail.
L’épaisseur standard de lamelle de 0,17 mm provient des propriétés physiques du verre borosilicaté et des exigences pratiques de l’imagerie biologique. À cette épaisseur, le verre est suffisamment fin pour permettre des distances de travail courtes et des angles de collecte de lumière élevés, tout en étant mécaniquement assez robuste pour être manipulé sans se casser. Les fabricants d’objectifs ont conçu leurs produits autour de cette valeur depuis plus d’un siècle, et la correction intégrée dans les objectifs apochromatiques modernes la suppose précise.
S’écarter de l’épaisseur standard introduit des erreurs optiques que l’objectif ne peut pas corriger seul.
Comment les objectifs sont corrigés pour l’épaisseur de la lamelle
Pour comprendre pourquoi l’épaisseur est importante, il est utile de comprendre ce que signifie réellement la correction d’un objectif au niveau de la conception des lentilles.
La lumière provenant d'un échantillon biologique traverse le substrat et parfois un milieu (c’est-à-dire l’huile), qui est la lamelle ou le fond de la boîte, avant d’entrer dans l’objectif. En traversant l’interface verre-milieu d’immersion, elle se réfracte. L’angle et le degré de cette réfraction dépendent à la fois de l’épaisseur du substrat et de son indice de réfraction. La conception de l’objectif prend généralement en compte cette réfraction en introduisant des éléments optiques compensateurs à l’intérieur du tube de l’objectif lui-même. Ces éléments sont calculés spécifiquement pour 0,17 mm de verre borosilicaté avec un indice de réfraction d’environ 1,515.
Cette correction est la plus élaborée et la plus critique dans les objectifs apochromatiques (APO), qui sont corrigés chromatiquement pour quatre longueurs d'onde et corrigés sphériquement pour plusieurs couleurs simultanément. Plus la correction intégrée dans un objectif est importante, plus il dépend précisément du respect des spécifications du substrat. Un objectif à immersion à l'huile plan-apochromatique 100⨉ représente le summum de cette philosophie de conception. Il est extraordinairement performant dans ses paramètres de conception et très sensible aux écarts dans la configuration.
→ Pour une explication détaillée des types d'objectifs, de la correction des aberrations et de l'ouverture numérique, voir Comprendre les objectifs de microscope.
Que se passe-t-il lorsque l'épaisseur s'écarte de 0,17 mm
Lorsque la lumière traverse un substrat plus épais, plus fin ou moins uniforme que la spécification de conception de l'objectif, la correction compensatrice à l'intérieur de l'objectif ne correspond plus à la réfraction réelle se produisant à l'interface du verre. Le résultat est une aberration sphérique. C'est une condition dans laquelle les rayons lumineux entrant dans l'objectif à différents angles se focalisent à des points légèrement différents le long de l'axe optique au lieu de converger sur un seul plan focal. En termes pratiques, l'aberration sphérique due à une épaisseur de substrat incorrecte produit :
Perte de résolution axiale – Les structures à différentes profondeurs dans l'échantillon semblent se focaliser à différents points, rendant l'imagerie en pile z et la reconstruction tridimensionnelle peu fiables.
Réduction de la résolution latérale – Les détails structurels fins qui devraient être distinguables se confondent, réduisant le pouvoir de résolution effectif de l'objectif en dessous de sa limite théorique.
Perte d'intensité – La lumière qui devrait contribuer à l'image nette est redistribuée en halos hors de foyer, réduisant l'intensité du signal et augmentant l'intensité du fond.
Déplacement du foyer – Le plan focal apparent se déplace par rapport à la position réelle de l'échantillon, ce qui affecte la précision du positionnement en z dans l'imagerie quantitative et les expériences sur cellules vivantes.
Ces effets augmentent avec l'ouverture numérique (NA). Un objectif sec 10⨉ avec une NA de 0,25 tolère relativement bien les variations du substrat. Un objectif à immersion huile 100⨉ avec une NA de 1,4 ne le tolère pas. À haute NA, même une déviation de 10 à 20 µm dans l'épaisseur du substrat entraîne une dégradation mesurable de l'image. C'est pourquoi la spécification du substrat est la plus importante précisément là où la performance d'imagerie compte le plus, c'est-à-dire aux grossissements et résolutions utilisés pour l'imagerie cellulaire et subcellulaire détaillée.
→ Pour les définitions de l'ouverture numérique, de la résolution et de la distance de travail, voir Bases du microscope.
Immersion, milieu et correspondance de l'indice de réfraction
L'épaisseur du substrat ne fonctionne pas isolément. Elle interagit directement avec le milieu d'immersion, le matériau remplissant l'espace entre la lentille frontale de l'objectif et la surface du substrat.
Les objectifs à immersion huile sont conçus pour une huile d'immersion spécifique avec un indice de réfraction de 1,515, proche de celui du verre borosilicaté. Cette correspondance minimise la réfraction à l'interface entre l'objectif et le substrat et permet à la correction interne de l'objectif de fonctionner comme prévu. Lorsque le substrat s'écarte du verre borosilicaté en indice de réfraction, en épaisseur ou les deux, la correspondance des indices de réfraction se dégrade et l'aberration sphérique augmente en conséquence.
Les objectifs à immersion eau sont conçus pour un indice de réfraction de 1,33 et sont intrinsèquement plus tolérants aux variations de substrat, ce qui en fait un meilleur choix pour les échantillons épais ou lors de l'imagerie à travers des milieux à forte teneur en eau. Les objectifs à sec, fonctionnant dans l'air avec un indice de réfraction de 1,00, sont les plus tolérants aux variations de substrat mais sont aussi limités en ouverture numérique (NA) et donc en résolution.
Pour l'imagerie en fluorescence à la plus haute résolution, souvent réalisée avec des objectifs à immersion huile, confocal, TIRF ou super-résolution, ces objectifs sont la norme. Ils sont aussi les plus sensibles aux spécifications du substrat. Les utiliser avec un substrat qui s'écarte du verre borosilicaté de 0,17 mm compromet l'adaptation de l'indice de réfraction pour laquelle l'objectif a été conçu, ce qui aggrave l'aberration sphérique causée par la variation d'épaisseur.
Bagues de correction : une solution de contournement, pas une solution définitive
Certains objectifs incluent une bague de correction, qui est un anneau réglable sur le corps de l'objectif permettant de déplacer les éléments internes de la lentille pour compenser la variation d'épaisseur du substrat. Les bagues de correction sont un outil utile, mais il est important de comprendre leurs limites.
Les bagues de correction s'adaptent généralement à une plage d'épaisseurs de substrat (souvent de 0,14 mm à 0,20 mm), bien que cela varie selon l'objectif. Dans cette plage, elles peuvent réduire de manière significative l'aberration sphérique causée par la variation d'épaisseur. Elles sont particulièrement utiles lors de l'imagerie à travers des milieux de profondeur variable ou lorsqu'on travaille avec des substrats non standard.
Cependant, les bagues de correction présentent des limites pratiques importantes :
- Ils nécessitent un réglage manuel et une observation directe de la qualité de l'image pour être correctement ajustés. Cela peut être un processus long qui introduit une variabilité liée à l'opérateur, en particulier dans les flux de travail d'imagerie automatisés ou à haut débit.
- Elles compensent uniquement la variation d'épaisseur. Elles ne corrigent pas l'inadéquation d'indice de réfraction entre le matériau du substrat et la spécification de conception de l'objectif. Une boîte en plastique avec la bonne épaisseur mais le mauvais indice de réfraction produira toujours des images aberrantes même avec une bague de correction correctement réglée.
- Elles ne sont pas disponibles sur tous les objectifs. De nombreux objectifs apochromatiques à immersion huile à haute NA, y compris ceux utilisés pour la TIRF et la super-résolution, sont des objectifs à correction fixe qui supposent un verre borosilicaté de 0,17 mm sans accommodation pour déviation.
L'approche la plus fiable est d'éliminer complètement la variable du substrat en utilisant une boîte qui respecte la spécification, plutôt que de compenser un substrat qui ne la respecte pas.
→ Pour des conseils sur l'ajustement de la mise au point et la configuration du microscope, voir Ajuster un microscope.
Pourquoi les boîtes en plastique ne respectent pas cette spécification
Les boîtes standard en plastique pour culture cellulaire ne respectent pas la spécification d'épaisseur de la lamelle sur deux points simultanément.
- Les boîtes en polystyrène sont fabriquées avec une épaisseur de base généralement comprise entre 1 mm et 2 mm, bien au-delà de la spécification de 0,17 mm et largement hors de la plage de compensation de toute bague de correction. La lumière traversant le fond d'une boîte en plastique rencontre plusieurs fois plus de matériau que ce que l'objectif à haute NA est corrigé pour, introduisant une aberration sphérique sévère qui ne peut être corrigée par ajustement.
- Le polystyrène a un indice de réfraction d'environ 1,59, ce qui diffère sensiblement du 1,515 du verre borosilicaté. Même si une boîte en plastique pouvait être fabriquée avec une épaisseur de 0,17 mm, son inadéquation d'indice de réfraction compromettrait toujours la correction optique intégrée à l'objectif.
Ces deux écarts se cumulent. Le résultat est que les boîtes en plastique sont fondamentalement incompatibles avec la conception optique des objectifs à haute NA, non pas en termes de degré, mais en termes de spécification. Aucun ajustement ne compense pleinement les deux variables simultanément.
Ceci est la base optique de la dégradation de l'imagerie décrite en termes pratiques dans Pourquoi les boîtes de Pétri en plastique déforment l'imagerie par fluorescence. L'aberration sphérique, la perte de résolution et la réduction du contraste que les chercheurs rencontrent lors de l'imagerie à travers du plastique sont la conséquence directe du non-respect par le substrat des spécifications d'épaisseur et d'indice de réfraction de la lamelle sur lesquelles leurs objectifs dépendent.
Comment FluoroDish™ répond à la norme
Les plats de culture cellulaire FluoroDish™ de WPI sont fabriqués avec un fond en verre de qualité optique correspondant à l'épaisseur standard des lamelles (~ 170 µm) avec l'indice de réfraction du verre borosilicaté. Cela signifie que le substrat répond aux deux spécifications requises par les objectifs à haute ouverture numérique.
La conséquence pratique est une compatibilité optique totale avec toute la gamme d'objectifs haute performance utilisés en microscopie à fluorescence moderne [plan-apochromats, objectifs à immersion huile, et lentilles à correction fixe utilisées pour les techniques TIRF et super-résolution]. Aucun réglage de bague de correction n'est nécessaire. Aucune compensation d'indice de réfraction n'est requise. L'objectif fonctionne comme son concepteur l'a prévu.
FluoroDish™ utilise également un adhésif biocompatible et sans cytotoxines pour fixer le fond en verre, ce qui le rend sûr pour les embryons, les cellules primaires et les modèles dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Disponible en plusieurs tailles et compatible avec des revêtements de surface tels que le collagène, la poly-D-lysine et la fibronectine, il prend en charge une large gamme de protocoles expérimentaux dans les applications d'imagerie académiques, CRO et pharmaceutiques.
→ Pour des conseils sur le choix du bon plat pour votre application spécifique en microscopie, voir Comment choisir le bon plat de culture cellulaire pour la microscopie.
Questions fréquemment posées
Que signifie 0,17 sur un objectif de microscope ?
Le chiffre 0,17 imprimé sur un objectif de microscope fait référence à l'épaisseur recommandée de la lamelle en millimètres, qui est le substrat pour lequel l'objectif a été optiquement corrigé. Les objectifs à haute ouverture numérique sont conçus autour de cette spécification, avec des éléments de lentille internes calculés pour compenser la réfraction introduite par 0,17 mm de verre borosilicaté. Utiliser un substrat d'épaisseur ou d'indice de réfraction différent introduit une aberration sphérique que l'objectif ne peut pas corriger de manière indépendante.
Que se passe-t-il si j'utilise une épaisseur de lamelle incorrecte ?
Utiliser un substrat plus épais, plus fin ou plus variable que 0,17 mm introduit une aberration sphérique. C'est une condition où les rayons lumineux entrant dans l'objectif sous différents angles se focalisent à des points légèrement différents. Les conséquences pratiques incluent une réduction de la résolution latérale et axiale, une perte d'intensité du signal, une augmentation du bruit de fond et un décalage du plan focal. Ces effets sont les plus sévères aux ouvertures numériques élevées, où la correction de l'objectif est étroitement liée à la spécification du substrat.
Puis-je utiliser une bague de correction pour compenser l'épaisseur d'une boîte en plastique ?
Non, pas efficacement. Les bagues de correction peuvent compenser les variations d'épaisseur du substrat dans une plage limitée, généralement de 0,14 mm à 0,20 mm. Les boîtes en plastique standard ont une épaisseur de base de 1 mm à 2 mm, ce qui est bien en dehors de cette plage et ne peut pas être corrigé. De plus, les bagues de correction ne corrigent pas le décalage d'indice de réfraction, et le polystyrène a un indice de réfraction d'environ 1,59 comparé à 1,515 pour le verre borosilicaté, une déviation qui persiste quel que soit le réglage de la bague.
Pourquoi les objectifs à immersion huile nécessitent-ils un verre d'épaisseur lamelle ?
Les objectifs à immersion huile sont conçus autour d'une correspondance spécifique d'indice de réfraction entre l'huile d'immersion (n ≈ 1,515) et le verre borosilicaté (n ≈ 1,515). Cette correspondance minimise la réfraction à l'interface objectif-substrat et permet à la correction interne de l'objectif de fonctionner comme prévu. Lorsque le matériau du substrat diffère du verre borosilicaté en épaisseur ou en indice de réfraction, cette correspondance est rompue et l'aberration sphérique augmente. Les objectifs à immersion huile fonctionnent avec les ouvertures numériques les plus élevées et sont donc les plus sensibles à cette déviation.
Les boîtes à fond en verre sont-elles compatibles avec les objectifs apochromatiques ?
Oui, à condition que le fond en verre soit fabriqué avec une épaisseur de lamelle (~170 µm) et un indice de réfraction corrects. FluoroDish™ répond à ces deux spécifications, ce qui le rend entièrement compatible avec les objectifs plan-apochromatiques, y compris les lentilles à immersion huile utilisées pour la microscopie confocale, TIRF et super-résolution. Aucun réglage de la bague de correction n'est nécessaire.
La épaisseur de la lamelle affecte-t-elle toutes les techniques de microscopie de la même manière ?
Non. Les techniques à faible grossissement et faible NA sont relativement tolérantes aux variations d'épaisseur du substrat. La spécification devient critique pour les objectifs à immersion huile à haute NA utilisés en microscopie confocale, TIRF, techniques de super-résolution et imagerie fluorescente détaillée. Ces techniques fonctionnent aux limites de résolution définies par la NA de l'objectif, et l'aberration sphérique due à une épaisseur de substrat incorrecte réduit directement la résolution et la qualité du signal atteignables à ces limites.
