NOTE D'APPLICATION : La technologie TEER permet un flux de travail in vitro optimisé pour la découverte de médicaments

Flux de travail optimisé in vitro pour identifier des composés aux propriétés vasoactives

In vitro les modèles ont utilisé deux méthodes courantes pour quantifier les changements dans l'intégrité de la barrière endothéliale : la résistance électrique transepitheliale/transendothéliale (TEER) et la perméabilité aux composés traceurs.¹ La TEER est une méthode non invasive qui quantifie les variations de conductance électrique pour mesurer la confluence et l'intégrité de la barrière. La perméabilité aux composés traceurs utilise des molécules de poids moléculaire défini pour mesurer la capacité d'exclusion de taille des barrières cellulaires (par exemple, FITC-dextran 4 kDa ou FD4).¹ En utilisant le EVOM™ Manual (EVOM-MT-03-01) avec l’électrode EndOhm TEER et des supports perméables pour culture cellulaire, cette note d’application décrit comment évaluer de manière non invasive l’intégrité de la barrière endothéliale après un traitement aux cytokines et fournit une méthode pour identifier des composés vasoactifs susceptibles d’induire des lésions vasculaires. Les études de perméabilité aux composés traceurs sont combinées à l’évaluation TEER pour élucider les impacts induits par le traitement sur les jonctions intercellulaires et le transport paracellulaire (Fig. 1).

Fig. 1 – Flux de travail pour mesurer l’activation endothéliale en utilisant les tests TEER et de perméabilité aux traceurs.

Les lésions vasculaires induites par les médicaments (DIVI) surviennent lorsque des composés vasoactifs endommagent le vaisseau endothélial et le muscle lisse environnant, provoquant une inflammation et le développement de lésions vasculaires.² La DIVI est difficile à prévoir et peut être induite par des médicaments de classifications diverses et de catégories spécifiques à certaines maladies.³ La toxicité médicamenteuse liée à la DIVI affecte environ 2,5 % des nouveaux candidats-médicaments, rendant l’identification précoce des composés vasoactifs cruciale pour le développement préclinique des médicaments.⁴

L’activation des cellules endothéliales (EC) est une étape précurseur importante dans la DIVI.⁵ Les EC adoptent ce phénotype pro-inflammatoire en réponse à une maladie (par exemple, sepsie, fièvre hémorragique virale), aux cytokines, aux forces mécaniques externes ou au traitement médicamenteux.⁶ L’activation des EC endommage et modifie l’intégrité du vaisseau endothélial, entraînant des changements dans la perméabilité vasculaire, le tonus vasomoteur et l’expression de biomarqueurs (par exemple, E-sélectine, P-sélectine, ICAM1, VCAM1).⁷ La perméabilité vasculaire est contrôlée par un système de jonctions intercellulaires comprenant les jonctions serrées (TJs) et les jonctions d’adhérence (AJs).⁸ Ces interactions protéine-protéine forment une barrière sélectivement perméable qui soutient le transport paracellulaire et maintient l’intégrité vasculaire.⁹ Lorsque les cellules endothéliales sont activées en réponse à un traitement par des composés vasoactifs, des lacunes endothéliales focales peuvent se former en raison de modifications de l’organisation des protéines des jonctions serrées. Ces lacunes modifient l’intégrité de la barrière et la taille des pores des jonctions intercellulaires, conduisant à une perméabilité endothéliale dysrégulée ou à une « fuite » vasculaire.⁸

Pour établir un modèle in vitro de mesure de l’activation des cellules endothéliales, des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) ont été ensemencées dans des inserts de culture cellulaire à une densité de 6 x 10⁴ cellules/cm² (Fig. 1). La TEER a été mesurée à l’aide du EVOM™ Manual avec l’électrode EndOhm TEER sur plusieurs jours jusqu’à atteindre la confluence. Les HUVEC en confluence ont été traitées avec 10 ou 50 ng/ml de TNF-alpha pendant 24 heures, puis mesurées par TEER. Un traceur fluorescent (FITC-dextran 4 kDa) a été ajouté à la chambre apicale pendant 1 heure, et la quantité de traceur dans la chambre basolatérale a été mesurée à l’aide d’un lecteur de plaques (Ex/Em 495/535).

Fig. 2 – Résultats TEER et perméabilité au traceur fluorescent pour les HUVEC traitées au TNF-alpha.

Le EVOM™ Manual avec l’électrode EndOhm TEER a mesuré une diminution de la TEER des HUVEC après 24 heures de traitement au TNF-alpha, et les valeurs TEER plus faibles étaient similaires pour les doses de 10 et 50 ng/ml (Fig. 2A). L’analyse de perméabilité utilisant un traceur fluorescent a montré que les HUVEC traitées avec 50 ng/ml de TNF-alpha étaient plus perméables au traceur fluorescent que les cellules traitées à 10 ng/ml à ce moment (Fig. 2B). La perméabilité des traceurs paracellulaires comme le FITC-dextran dépend de la taille des pores des jonctions serrées et du flux d’eau paracellulaire, tandis que les valeurs TEER sont impactées par la conductance ionique.¹ Les HUVEC traitées au TNF-alpha montrent des modifications des capacités d’exclusion de taille des jonctions serrées (perméabilité ; Fig. 2B), ainsi que des changements dans le transport paracellulaire (TEER ; Fig. 2A). Ensemble, ces données démontrent comment le EVOM™ Manual avec l’électrode EndOhm peut être utilisé en combinaison avec des tests de perméabilité aux traceurs pour évaluer les impacts des cytokines sur les jonctions intercellulaires et les changements dans les états d’activation endothéliale.

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Références

Felix K, Tobias S, Jan H, Nicolas S, Michael M. (2021) Histochem Cell Biol. 156(6):609-616. PMID 34459960
Yaseen K, Nevares A, et Tamaki H. (2022) Curr Rheumatol Rep. 24(11):323-336. PMID 36129631
Zhang J, Hanig JP, et De Felice AF. (2012) Vascul Pharmacol. 56(1-2):14-25. PMID 21968053
CDER U.S. Food and Drug Administration. Innovative Medicines Initiative – TransBioLine Drug-induced Vascular Injury Work Package DDTBMQ000037 Letter of Intent. U.S. Food and Drug, Silver Spring, MD, 2019.
Ricard N, Bailly S, Guignabert C, et Simons M. (2021) Nat Rev Cardio. 18:565-580. PMID 33627876
Siddal E, Khatri M, et Radhakrishnan J. (2017) Kidney Int. 92(1):37-46.
Frazier KS, Engelhardt JA, et al. (2015) Toxicol Pathol. 43(7):915-934. PMID 25722122
Claesson-Welsh L, Dejana E, et McDonald DM. (2021) Trends Mol Med. 27(4):314-331. PMID 33309601
Srinivasan B, Kolli AR, et al. (2015) J Lab Autom. 20(2):107-126. PMID 25586998