Détection du Ca2+ dans le tissu musculaire par spectroscopie de fluorescence

L'utilisation de sondes fluorescentes en physiologie cellulaire est devenue un outil indispensable dans l'analyse du fonctionnement cellulaire ces dernières années. La physique sous-jacente à la fluorescence est illustrée par le diagramme des états électroniques (appelé diagramme de Jablonski, voir Fig. 1), montrant le processus en trois étapes pour créer le signal fluorescent (Excitation - Durée de vie de l'état excité - Émission de fluorescence) dans un fluorophore/indicateur, décrit de manière simplifiée ci-dessous.

Fig. 1 – Diagramme de Jablonski illustrant les processus de fluorescence par absorption d'une énergie photonique plus élevée par un fluorophore et émission subséquente d'une énergie photonique plus faible, résultant en une fluorescence durant la durée de vie de la fluorescence.

La fluorescence est obtenue lorsqu'un photon d'excitation (hν_EX) provenant d'une source externe, telle qu'une LED haute puissance, est absorbé par un fluorophore qui élève son énergie (S1’). Pendant la durée de vie de la fluorescence, l'énergie élevée (S1’) décroît vers un état d'énergie plus faible S1. Ensuite, la fluorescence résulte en l'émission d'un photon d'énergie plus faible (hν_EM) et donc de longueur d'onde plus longue. Fondamental en spectroscopie est la différence d'énergie ou de longueur d'onde représentée par (hν_EX-hν_EM), appelée décalage de Stokes. Le décalage de Stokes permet une discrimination efficace de l'excitation, faisant de la fluorescence une technique très sensible et détectable sur un faible bruit de fond, isolée des photons d'excitation.

Fig. 2 – Diagramme typique excitation-émission, montrant le spectre d'absorption d'une molécule à une longueur d'onde plus courte (c’est-à-dire une énergie plus élevée) d'une source d'excitation correspondante et le spectre de fluorescence résultant de la lumière émise à une longueur d'onde plus longue (c’est-à-dire un état d'énergie plus faible).

Quatre éléments essentiels du signal fluorescent peuvent alors être identifiés pour construire un système de détection :

• Source lumineuse d'excitation adaptée à la bande d'absorption du fluorophore (par exemple LED haute puissance de longueur d'onde spécifique)
• Un fluorophore/indicateur (par exemple Fura-8 pour la détection du Ca²⁺ libre dans le tissu musculaire)
• Filtres de longueur d'onde d'émission pour limiter la bande passante des photons émis ou des bandes chevauchantes
• Un système détecteur qui enregistre la lumière fluorescente et produit une sortie enregistrable sous forme de signal électrique (par exemple tubes photomultiplicateurs).

Quelle que soit l'application, la compatibilité de ces quatre éléments est essentielle pour optimiser la détection de fluorescence.

Exemple de détection du Ca²⁺ libre dans le tissu musculaire

Typiquement, un colorant fluorescent est introduit dans le tissu ou les cellules isolées pour obtenir une réponse fluorescente de la molécule marquée. Un exemple typique est la détection de l'augmentation transitoire de la concentration cytoplasmique/myoplasmique de calcium libre (Δ[Ca²⁺]) comme événement intermédiaire de signalisation du couplage excitation-contraction. La quantification de Δ[Ca²⁺] est réalisée en utilisant une lumière monochromatique pour exciter la molécule de Ca²⁺ marquée par le colorant dans un échantillon de tissu/cellule, soit dans un bain tissulaire, soit dans un montage expérimental microscopique. Le signal de fluorescence émis par le colorant indicateur peut alors être utilisé pour surveiller l'amplitude et la cinétique de Δ[Ca²⁺] détectée par des détecteurs sensibles, tels que des tubes photomultiplicateurs très sensibles (module PMT) ou des caméras.

Le colorant indicateur ratiométrique Fura-8™ est bien adapté à la détection des transitoires de Δ[Ca²⁺]. Fura-8™ est excité à des longueurs d'onde de 365 nm et 410 nm et l'émission est enregistrée à 525 nm en mode double excitation/émission simple, c’est-à-dire mesure ratiométrique. Les avantages de choisir cette technique de mesure ratiométrique sont :

• La minimisation des artéfacts de mouvement
• L'annulation des effets possibles d'un chargement inégal
• La distribution inhomogène de l'indicateur fluorescent dans les cellules
• Le photoblanchiment du colorant indicateur dans la détection des transitoires de Δ[Ca²⁺] dans le tissu musculaire.

Cela a permis la quantification et la comparaison entre :

• Techniques à haute résolution spatiale versus haute résolution temporelle sur des tranches du ventricule gauche humain
• La possibilité de mesurer les transitoires de concentration de calcium libre (Δ[Ca²⁺]) dans un bain tissulaire horizontal sur des tranches du ventricule gauche humain ou des tranches murines.

Fig. 3 – Représentation qualitative de certains résultats de détection du Ca²⁺ libre dans des tranches de cœur humain utilisant le système SI-BF-100.

Intensités moyennes de fluorescence des tranches du ventricule gauche humain chargées en Fura-8 détectées à 525 nm, lorsqu'excitées respectivement à 340 nm et 410 nm, et ratios calculés (trace inférieure) à partir des données d'imagerie d'une caméra Rolera EM-C² (à gauche). À droite, la réponse du SI-BF-100 détectée avec deux réglages d'ouverture et les ratios calculés (traces inférieures). De plus, les données fluorescentes collectées avec le petit réglage d'ouverture et filtrées en passe-bas à 50 Hz sont montrées. Notez la grande différence temporelle dans la détection du signal de fluorescence entre les données d'imagerie (Rolera EM-C²) et la détection SI-BF-100 (intervalle de 210 ms contre 1 ms), permettant la détection de transitoires de Ca²⁺ changeant rapidement (d’après Belz et al., lettres SPIE, 2016).

Références

Belz M., et. al. Biofluoromètre à fibre optique pour la recherche physiologique sur des tranches musculaires. Proc. SPIE 9702, Optical Fibers and Sensors for Medical Diagnostics and Treatment Applications XVI, 2016.

Spectrophotométrie. Wikipédia, l'encyclopédie libre, 2017 (références croisées).