VIDEO: Reseña del investigador sobre el EVOM3
por Benjamin Dubansky, PhD, Fisiólogo/Investigador Animal
El EVOM es un tipo especial de voltímetro para medir propiedades eléctricas a través de una capa de células en cultivo o una membrana biológica. Es el sistema comercial más utilizado para medir a través de una capa de células cultivadas. Estamos midiendo la TEER (TER) - Resistencia Eléctrica Transepithelial. El EVOM3 nos permite acercarnos y medir ya sea la resistencia o el voltaje a través de estas membranas o células en cultivo.
¿Por qué fue inventado?
El EVOM (Medidor Volt-Ohm Epitelial) fue diseñado en los años 80. Fue inventado cuando se introdujeron por primera vez las placas de cultivo multi-pozo. Poco después aparecieron los insertos permeables, que nos permitieron suspender una capa de células en medio de cultivo.
Cuando colocas tus células en estos insertos permeables, se dividen y forman una capa confluente a través del inserto permeable. A medida que las células crecen hasta confluir, puedes usar el EVOM para observar cómo la resistencia aumenta hasta estabilizarse. Una vez que obtienes una capa ajustada y confluente con uniones intercelulares, puedes comenzar tus experimentos.
¿Qué tipo de experimentos puedes hacer con un EVOM3?
¡De todo! Una vez que tienes una capa confluente con uniones intercelulares sobre un sustrato permeable, esencialmente tienes una capa de epitelio con propiedades de barrera y transporte de una membrana biológica, pero en cultivo. Podrías añadir una sustancia en un lado y monitorear el transporte o la respuesta celular.
Esto significa que puedes trabajar con las propiedades de barrera de endothelia, como la barrera hematoencefálica, donde puedes seguir el potencial de permeabilidad a fármacos, o los efectos de xenobióticos en estudios de toxicidad a través de capas de células epiteliales. EVOM3 es capaz de manejar miles de aplicaciones en ciencias básicas, incluyendo estudios mecanicistas para descubrir mecanismos de transporte a partir de canales iónicos, transporte mediado por receptores, transporte paracelular, uniones intercelulares, cicatrización de heridas, remodelación y más. Una vez que las células están en los insertos, también pueden ser imagenadas.
¿En qué se parece el EVOM3 a una cámara de Ussing?
Esto suena como la cámara de Ussing, pero no del todo. La cámara de Ussing produce un campo uniforme a través de la membrana que te permite aplicar un voltaje constante a través del epitelio y un monitoreo más uniforme de toda la lámina epitelial al mismo tiempo. La cámara de Ussing es realmente para tejido explantado. Por ejemplo, puedes cortar un pedazo de intestino y cultivarlo en una cámara de Ussing para estudiar transporte o propiedades de barrera similares a lo que acabo de describir. La desventaja de una cámara de Ussing es que solo puedes hacer un par de muestras a la vez. Una cámara de Ussing definitivamente no es una placa de 24 pozos. Hay formas de adaptar el EVOM3 para obtener datos similares a los de una cámara de Ussing con mayor rendimiento. Aunque el EVOM3 no es tan exacto como una cámara de Ussing, sigue siendo una plataforma sólida con un rendimiento mucho mayor que una cámara de Ussing.
La forma más fácil de usar el EVOM3 es simplemente tomar tus mediciones durante un experimento para monitorear cambios que puedan ocurrir durante el tratamiento. O puedes usar la configuración de electrodos EndOhm . Aunque el EVOM3 no es tan exacto como la cámara de Ussing, aún puedes obtener datos similares a los de una cámara de Ussing con la serie EVOM, especialmente con los modelos nuevos (EVOM3).
¿Por qué el EVOM3 es mucho mejor que los modelos anteriores?
EVOM3 es más rápido
La nueva versión, como puedes imaginar, es mucho más rápida. Reporta valores más rápido porque hay menos espera para que los valores se estabilicen. Esto facilita mucho pasar por una placa. La mayor velocidad te permite medir la misma placa varias veces para seguir los cambios durante un experimento de manera mucho más efectiva que antes.
Ajusta la resistencia
También puedes ajustar la resistencia objetivo. No parece gran cosa, pero lo es. El epitelio de las vías respiratorias o la microvasculatura tienen una resistencia muy baja (100 Ω/cm2) frente a la barrera hematoencefálica que puede tener varios miles de ohmios (5,000 Ω/cm2). Los diferentes sistemas también varían.
- Temperatura (37°C vs temperatura ambiente)
- Número de pasajes celulares
- Medio de cultivo (muy importante)
- Cuánto tiempo esperas después de la confluencia
- Configuración del electrodo
Con el nuevo EVOM3, hay una función automática para encontrar rangos objetivo, ya que esto puede cambiar a medida que las células crecen hasta confluir. Si estás intentando cultivar una nueva línea celular, probablemente no conocerás los rangos de resistencia que encontrarás, y tus valores pueden ser diferentes a los reportados debido a los factores mencionados arriba. Menciono esto por mi propia experiencia con cultivos celulares. En nuestro caso durante la maestría, estábamos haciendo cultivos primarios de células de branquias de pez. No es un objetivo fácil. El EVOM antiguo que teníamos requería personalización en el fabricante para obtener la resistencia objetivo para branquias de pez.
Hoy en día, el nuevo EVOM3 puede alternar entre varias corrientes de medición dependiendo de tus rangos de resistencia objetivo, pero también tiene un ajuste automático para encontrar rangos de resistencia. Es mucho más versátil para cultivos primarios o si crees que podrías usar más de un tipo celular.
Diseño práctico
Muchos dispositivos tienen pedales porque liberan las manos. En este caso, significa que no tienes que tocar nada, minimizando el potencial de contaminación. El pedal también registra la medición. Cada vez que estés listo para registrar una medición, presionas el pedal y se ingresa una lectura.
Lo genial es que se registra en formato de hoja de cálculo mientras te mueves de pozo en pozo. No necesitas escribir nada, lo que libera aún más tus manos y elimina la necesidad de entrar y salir de la campana de flujo laminar. Esto realmente mejora la eficiencia del flujo de trabajo. ¡Deberías ver mis cuadernos de laboratorio! Normalmente tienes que ingresar los datos en una hoja de cálculo de todos modos. Ahora, se guarda automáticamente en una memoria USB en formato CSV.
Nuevo diseño de electrodos
Muchos factores pueden introducir inconsistencias en las lecturas (temperatura, medio, consumibles, tiempo, placas y electrodos). Los electrodos STX2 antiguos usados en la mayoría de los casos requieren una mano firme, y solía ser un problema que si no eres consistente en cómo sostienes los electrodos (profundidad, ángulo, etc.), corres el riesgo de obtener datos inconsistentes. Ahora, los electrodos están fijados con una guía que encaja en el inserto del pozo. Cuando colocas los electrodos en cada pozo, están en el mismo lugar, a la misma profundidad y a la misma distancia entre sí, en cada caso. Puedes ajustar la alineación una vez y recorrer una placa sabiendo que serás consistente. Esto también ahorra mucho tiempo. Es simplemente mucho más fácil de usar.
Mejor resolución, pantalla táctil, sustracción de blanco
Aquí algunos otros grandes beneficios del EVOM3.
- La resolución es mejor, como imaginarías.
- La pantalla moderna y la interfaz táctil simplifican el uso.
- Puedes restar valores de control. Eso es útil.
- Como es mucho más rápido y obtienes valores más consistentes con los electrodos, las lecturas estables y el manejo de datos, puedes realizar experimentos temporizados con facilidad.
- Los cálculos de TEER son fáciles. Solo multiplica la resistencia por el área superficial del inserto/capa celular. Puedes hacer esto a lo largo del tiempo y ver cambios en las uniones intercelulares, como las uniones estrechas, aunque será semicuantitativo, pero aún relevante.
NOTA: Si requieres mayor precisión, puedes usar la configuración de electrodos EndOhm, que se conecta al EVOM3. Con eso, tienes que retirar el inserto y colocarlo en una cámara que tiene electrodos perfectamente alineados, algo así como una cámara de Ussing. Está bastante bien diseñado para obtener mediciones rápidas y consistentes. Tendrás que mover tus insertos. Este es un proceso más lento, pero si haces un buen trabajo limpiando y manteniendo tu trabajo estéril, los electrodos ENDOHM son increíbles. Son un poco más lentos, por lo que el rendimiento es menor, pero mucho más rápido que una cámara de Ussing. Y estás usando células cultivadas, así que eso cuenta.
