Cómo solucionar problemas de medición TEER
Por Subhra Nag, PhD
La medición de la resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER) es una de las prácticas más utilizadas para evaluar la salud celular, como la confluencia celular, la integridad de la barrera o la función de barrera de monocapas celulares cultivadas en placas multipocillo. La medición TEER utilizando el Voltohmímetro Epitelial (EVOM) de WPI se considera el estándar de oro debido a sus mediciones confiables y numerosas citas en la literatura usando varios tipos celulares. El Manual EVOM™ y el EVOM™ Auto, junto con diferentes opciones de electrodos (STX4, STX HTS para cribado de alto rendimiento, cámaras EndOhm y matriz multielectrodo para EVOM™ Auto) permiten a los investigadores realizar y analizar muestras celulares en insertos removibles de 6, 12 y 24 pocillos y en formatos de placas multipocillo de 24 y 96 HTS. Los principales desafíos que los investigadores pueden encontrar al realizar estudios para capturar la medición TEER incluyen:
- Lecturas inestables
- Valores fuera de rango
- Mediciones inconsistentes entre réplicas de muestras o lotes.
Considere los siguientes factores para superar cualquier problema en la medición TEER y obtener mediciones precisas y confiables:
Presencia de Líquido Conductivo en las Muestras
Para obtener mediciones estables, las puntas del electrodo (regiones activas de detección) deben permanecer sumergidas en un líquido conductor como, por ejemplo, tampón 1XPBS, medio de cultivo celular, etc. El agua desionizada no funcionará. Para que la corriente aplicada por el EVOM fluya a través de las muestras, la solución debe contener iones (por ejemplo, iones cloruro). Las concentraciones iónicas y los valores de resistencia eléctrica medidos mantienen una relación inversa. Con el aumento de la fuerza iónica o concentración, el valor de resistencia debería disminuir inversamente. Para lograr mediciones estables y consistentes y hacer comparaciones significativas, use el mismo medio o solución tampón en todas las muestras.
Volúmenes Adecuados de Líquido
Los volúmenes del líquido en la parte superior (apical) y en la parte inferior (basolateral) de la membrana del multipocillo o inserto de cultivo celular deben ser adecuados para que las puntas del electrodo puedan permanecer completamente sumergidas en la solución conductora. La falta de volúmenes adecuados de líquido puede resultar en lecturas inestables o valores fuera de rango, ya que el electrodo no puede pasar la corriente eléctrica de manera consistente a través de las muestras. Si la membrana del inserto de cultivo celular está rota, el líquido apical se moverá fácilmente hacia el lado basolateral. Estas muestras deben omitirse de los estudios ya que la corriente eléctrica puede desplazarse por la vía de fuga del líquido de la muestra y proporcionaría una estimación inexacta de la resistencia eléctrica. Use volúmenes consistentes de líquidos para obtener lecturas consistentes.
Seleccione un Electrodo que Coincida con el Tipo de Inserto/Placa
WPI ofrece una amplia variedad de electrodos que coinciden con las dimensiones y geometría de los insertos de cultivo celular comúnmente usados (por ejemplo, Corning, Millipore, MatTek, Greiner) con diferentes tamaños (6, 12, 24 y 96 pocillos). WPI recomienda usar un electrodo que coincida con el inserto de cultivo celular o tipo de multipocillo para obtener los mejores resultados. Por ejemplo, para insertos Corning 3460 de 12 pocillos, se debe usar el ENDOHM-12 (Número de parte ENDOHM-12G para EVOM2 o EVM-EL-03-01-02 para EVOM™ Manual). Los datos obtenidos con un electrodo no compatible pueden ser significativamente inexactos.
Posición del Electrodo Sobre las Muestras
La posición del electrodo (incluida su profundidad en las muestras) puede afectar las lecturas de resistencia bruta. La colocación consistente del electrodo proporciona un camino fijo o constante para el flujo de corriente eléctrica aplicada a través de las muestras y elimina o minimiza las variaciones en las lecturas de resistencia eléctrica. Los electrodos avanzados de WPI, como ENDOHM o STX HTS, cuando se usan correctamente con multipocillos compatibles, minimizan esta variabilidad en la lectura debido a la capacidad de posicionamiento consistente del electrodo. Al usar EVOM™ Auto, el movimiento operado por brazo robótico automatizado también elimina este efecto cuando se usa consistentemente la misma configuración de matriz de electrodos/perfil de placa.
Uso de un Blanco y Sustracción del Blanco
La “muestra en blanco” se refiere a un inserto de cultivo celular o multipocillo sin células que también cumple con las mismas condiciones experimentales (incluyendo el mismo tipo y volumen de líquido). Restar el valor de resistencia del blanco de la resistencia de la muestra y luego calcular los valores TEER ayuda a minimizar los efectos de parámetros variables, como la posición del electrodo, tipo y volumen del líquido de la muestra. Tanto los sistemas EVOM™ Manual como EVOM™ Auto permiten guardar los valores en blanco y restarlos automáticamente de los valores de resistencia de las muestras.
Medir las Muestras a Temperatura Estable
WPI recomienda sacar las placas del incubador para aclimatar las muestras a temperatura ambiente dentro de la campana laminar de cultivo celular durante 20 minutos antes de tomar la medición. Cuando una placa se saca directamente de un incubador a 37°C y se mide, pueden observarse grandes variaciones entre muestras, ya que la muestra 1 puede estar a 37°C, mientras que la muestra 12 de la misma placa puede estar a 32°C. De manera similar, se debe añadir medio/solución aclimatada a temperatura ambiente en caso de que se agregue alguna solución antes de la medición. Se sabe que la temperatura afecta la permeabilidad de las uniones estrechas y, por lo tanto, puede afectar las lecturas TEER. Por lo tanto, las mediciones deben tomarse a una temperatura estable para obtener lecturas estables.
Limpieza y Mantenimiento del Electrodo
La limpieza y mantenimiento regular/diario del electrodo es fundamental para la longevidad funcional del electrodo. Los electrodos tienden a acumular depósitos de sal y proteínas del medio o tampón si no se limpian inmediatamente después de su uso o al final del día. Esta deposición puede bloquear la región activa de detección del electrodo y resultar en lecturas bajas o inestables. WPI recomienda la limpieza regular del electrodo al final del día después de su uso para asegurar que la región de detección del electrodo no forme depósitos.
Las puntas del electrodo normalmente se lavan con etanol o isopropanol, seguido de un enjuague con agua desionizada. Las puntas del electrodo deben secarse al aire y el electrodo debe almacenarse en condiciones secas. Se recomienda la limpieza periódica de las puntas del electrodo usando detergentes proteolíticos como Enzol o Alconox para prevenir depósitos de proteínas. La parte restante del electrodo, aparte de la punta con la región activa de detección, no puede sumergirse en ningún líquido y puede limpiarse con una toalla de papel rociada con alcohol. Periódicamente, clore el electrodo sumergiendo las puntas en hipoclorito de sodio al 3-6% (lejía) durante 10 minutos seguido de un enjuague con agua desionizada. Esto se recomienda para reponer el cloruro de plata para el correcto funcionamiento del electrodo y lecturas estables. Consulte la sección específica de limpieza y mantenimiento del electrodo en el manual de instrucciones para más detalles.
Siguiendo las sugerencias anteriores para sus experimentos de medición TEER, puede esperar superar los problemas de medición TEER y lograr resultados estables y reproducibles. Si tiene alguna pregunta, simplemente llámenos al (866) 606-1974 o envíenos un correo electrónico a wpi@wpiinc.com.
