NOTA DE APLICACIÓN: La tecnología TEER permite un flujo de trabajo in vitro optimizado para el descubrimiento de fármacos

Flujo de trabajo optimizado in vitro para identificar compuestos con propiedades vasoactivas

In vitro se han empleado dos métodos comunes para cuantificar los cambios en la integridad de la barrera endotelial: resistencia eléctrica transepitelial/transendotelial (TEER) y permeabilidad a compuestos trazadores.¹ TEER es un método no invasivo que cuantifica los cambios en la conductancia eléctrica para medir la confluencia y la integridad de la barrera. La permeabilidad a compuestos trazadores utiliza moléculas de pesos moleculares definidos para medir la capacidad de exclusión por tamaño de las barreras celulares (por ejemplo, FITC-dextrano de 4 kDa o FD4).¹ Usando el EVOM™ Manual (EVOM-MT-03-01) con el electrodo EndOhm TEER y soportes permeables para cultivo celular, esta nota de aplicación describe cómo evaluar de forma no invasiva la integridad de la barrera endotelial tras el tratamiento con citoquinas y proporciona un método para identificar compuestos vasoactivos que tienen el potencial de inducir daño vascular. Los estudios de permeabilidad a compuestos trazadores se combinan con la evaluación TEER para dilucidar los impactos inducidos por el tratamiento tanto en las uniones intercelulares como en el transporte paracelular (Fig. 1).

Fig. 1– Flujo de trabajo para medir la activación endotelial usando ensayos de TEER y permeabilidad con trazadores.

La lesión vascular inducida por fármacos (DIVI) ocurre cuando compuestos vasoactivos dañan el vaso endotelial y el músculo liso circundante, causando inflamación y desarrollo de lesiones vasculares.² DIVI es difícil de predecir y puede ser inducida por fármacos de diversas clasificaciones y categorías específicas de enfermedades.³ La toxicidad relacionada con DIVI afecta alrededor del 2.5% de los nuevos candidatos a fármacos, haciendo crítica la identificación temprana de compuestos vasoactivos para el desarrollo preclínico de fármacos.⁴

La activación de células endoteliales (EC) es un paso precursor importante en DIVI.⁵ Las EC adoptan este fenotipo proinflamatorio en respuesta a enfermedades (por ejemplo, sepsis, fiebre hemorrágica viral), citoquinas, fuerzas mecánicas externas o tratamiento farmacológico.⁶ La activación de EC daña y altera la integridad del vaso endotelial, conduciendo a cambios en la permeabilidad vascular, el tono vasomotor y la expresión de biomarcadores (por ejemplo, E-selectina, P-selectina, ICAM1, VCAM1).⁷ La permeabilidad vascular está controlada por un sistema de uniones intercelulares que incluyen uniones estrechas (TJs) y uniones adherentes (AJs).⁸ Estas interacciones proteína-proteína forman una barrera selectivamente permeable que soporta el transporte paracelular y mantiene la integridad vascular.⁹ Cuando las células endoteliales se activan en respuesta al tratamiento con compuestos vasoactivos, pueden formarse brechas endoteliales focales debido a cambios en la organización de las proteínas de las uniones estrechas. Estas brechas alteran la integridad de la barrera y el tamaño de los poros de las uniones intercelulares, conduciendo a una permeabilidad endotelial desregulada o “fugas” vasculares.⁸

Para establecer un modelo in vitro para medir la activación de células endoteliales, se sembraron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) en insertos de cultivo celular a una densidad de 6 x 10⁴ células/cm2 (Fig. 1). Se midió TEER usando el EVOM™ Manual con el electrodo EndOhm TEER durante varios días hasta alcanzar la confluencia. Las HUVECs confluentes fueron tratadas con 10 o 50 ng/ml de TNF-alfa durante 24 horas y medidas por TEER. Se añadió un trazador fluorescente (FITC-dextrano de 4 kDa) a la cámara apical durante 1 hora, y la cantidad de trazador en la cámara basolateral se midió usando un lector de placas (Ex/Em 495/535).

Fig. 2– Resultados de TEER y permeabilidad con trazador fluorescente para HUVECs tratadas con TNF-alfa.

El EVOM™ Manual con el electrodo EndOhm TEER midió una disminución en TEER de HUVECs tras 24 horas de tratamiento con TNF-alfa, y los valores más bajos de TEER fueron similares para ambas dosis de 10 y 50 ng/ml (Fig. 2A). El análisis de permeabilidad usando un trazador fluorescente mostró que las HUVECs tratadas con 50 ng/ml de TNF-alfa fueron más permeables al trazador fluorescente que las células tratadas con 10 ng/ml en este punto temporal (Fig. 2B). La permeabilidad de trazadores paracelulares como el FITC-dextrano depende del tamaño de los poros de las uniones estrechas y del flujo de agua paracelular, mientras que los valores de TEER se ven afectados por la conductancia iónica.¹ Las HUVECs tratadas con TNF-alfa muestran cambios en las capacidades de exclusión por tamaño de las uniones estrechas (permeabilidad; Fig. 2B), así como cambios en el transporte paracelular (TEER; Fig. 2A). En conjunto, estos datos demuestran cómo el EVOM™ Manual con el electrodo EndOhm puede usarse en combinación con ensayos de permeabilidad con trazadores para evaluar los impactos de las citoquinas en las uniones intercelulares y los cambios en los estados de activación endotelial.

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Referencias

1. Felix K, Tobias S, Jan H, Nicolas S, Michael M. (2021) Histochem Cell Biol. 156(6):609-616. PMID 34459960
2. Yaseen K, Nevares A, y Tamaki H. (2022) Curr Rheumatol Rep. 24(11):323-336. PMID 36129631
3. Zhang J, Hanig JP, y De Felice AF. (2012) Vascul Pharmacol. 56(1-2):14-25. PMID 21968053
4. CDER U.S. Food and Drug Administration. Innovative Medicines Initiative – TransBioLine Drug-induced Vascular Injury Work Package DDTBMQ000037 Carta de Intención. U.S. Food and Drug, Silver Spring, MD, 2019.
5. Ricard N, Bailly S, Guignabert C, y Simons M. (2021) Nat Rev Cardio. 18:565-580. PMID 33627876
6. Siddal E, Khatri M, y Radhakrishnan J. (2017) Kidney Int. 92(1):37-46. 
7. Frazier KS, Engelhardt JA, et al. (2015) Toxicol Pathol. 43(7):915-934. PMID 25722122
8. Claesson-Welsh L, Dejana E, y McDonald DM. (2021) Trends Mol Med. 27(4):314-331. PMID 33309601
9. Srinivasan B, Kolli AR, et al. (2015) J Lab Autom. 20(2):107-126. PMID 25586998