ANWENDUNGSHINWEIS: Beobachtung der Mitose mit Celloger® Mini Plus

Einleitung

Im Prozess des „Zellzyklus“ wachsen Zellen und teilen sich in zwei genetisch identische Tochterzellen. Dieser wird durch einen komplexen Signalweg reguliert, der die Zellhomöostase durch Steuerung der Zellteilung und DNA-Verdopplung aufrechterhält¹. Andererseits werden Anti-Mitose-Medikamente eingesetzt, um das abnormale Wachstum von Krebszellen zu unterdrücken, da Krebszellen unkontrolliert und unbegrenzt außerhalb des Zellzyklus wachsen und sich teilen². Insbesondere ist Nocodazol als ein repräsentatives Anti-Mitose-Medikament für die Krebstherapie bekannt und zeichnet sich dadurch aus, dass es die Dynamik der Mikrotubuli während der zytoplasmatischen und nuklearen Teilung stört^3,4.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir die anti-mitotische Wirkung von Nocodazol auf eine Krebszelllinie, indem wir den Zellteilungsprozess überwachten. Zu diesem Zweck wurden Hela-Zellen stabil mit grün fluoreszierendem Protein fusioniertem Histon 2B (H2B-GFP) transfiziert, das die Dynamik der Chromosomenstruktur während des Zellzyklus sichtbar macht⁵. Anschließend wurde die Zellteilung in Echtzeit nach Behandlung der Zellen mit oder ohne Nocodazol mithilfe des Celloger® Mini Plus, einem Gerät zur Lebendzellbildgebung, überwacht.

Methode

Mit H2B-GFP-Plasmid transfizierte HeLa-Zellen wurden mit 4 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte ausgesät. Die Zellen wurden in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium mit 10 % fötalem Kälberserum und 300 µg/mL G418 kultiviert. Nach einer Übernachtkultur zur Zelladhäsion wurden die Zellen mit oder ohne 62,5 nM Nocodazol inkubiert, und die Echtzeit-Bildgebung erfolgte mit dem Celloger® Mini Plus (Hellfeld- und grüner Fluoreszenzkanal, 10X Optik). Bilder wurden alle 15 Minuten über 24 Stunden aufgenommen.

Ergebnisse

Hellfeld- und Fluoreszenz-Zeitrafferaufnahmen von Hela-Zellen, die mit grün fluoreszierendem Protein fusioniertem H2B transfiziert wurden, wurden durchgeführt, um nukleare Veränderungen während der Mitose zu beobachten. Im Hellfeldbild war die Kernmembran zu Beginn deutlich sichtbar, verschwand dann allmählich, und die Metaphase, in der die Chromosomen in der Zellmitte ausgerichtet sind, wurde sowohl im Hellfeld- als auch im Fluoreszenzbild beobachtet (Abbildung 1A). Zu diesem Zeitpunkt waren die Chromosomen kondensiert, und die Fluoreszenz war im Vergleich zur vorherigen Phase intensiver. Chromosomen, die in die spätere Phase eintraten, wurden in zwei Schwesterchromatiden getrennt, die jeweils zu entgegengesetzten Zellpolen wanderten. Wie im letzten Bild gezeigt, entstanden schließlich zwei Tochterzellen in der Telophase. Im Gegensatz dazu setzte sich der Zellteilungsprozess in den mit Nocodazol behandelten Zellen nicht fort, da die Chromatiden nicht an beide Enden getrennt werden konnten. Im Hellfeldbild blieben die Zellen weiterhin nicht am Boden haften, und es wurde bestätigt, dass die DNA schließlich fragmentiert wurde, was im Fluoreszenzbild zu Apoptose führte (Abbildung 1B).

Abbildung 1. Zeitrafferaufnahmen von H2B-GFP-transfizierten Hela-Zellen mit oder ohne Nocodazol.

Fazit

Fluoreszenzmarkierung ist ein nützliches Werkzeug, um die Dynamik von Organellen in lebenden Zellen zu beobachten. Bisher wurden Plasmide entwickelt, um verschiedene Organellen oder Zielproteine mithilfe von fluoreszierenden Fusionsproteinen sichtbar zu machen, und viele Studien wurden durchgeführt, um Veränderungen in Organellen oder Proteintranslokation durch verschiedene Stimuli zu überprüfen.

In dieser Anwendungshinweis führten wir eine nukleare Markierungsmethode mit Histon und grün fluoreszierendem Fusionsprotein durch, das an DNA bindet. Um die Wirkung von Nocodazol auf die Zellteilung zu bestätigen, wurden die Zellen über die Zeit überwacht und Bilder mit dem Celloger® Mini Plus, einem Echtzeit-Lebendzellbildgebungssystem, aufgenommen. Das System verfügt über eine voll motorisierte Kamera, die die Bildgebung an verschiedenen Positionen in einem vom Benutzer programmierten Intervall ermöglicht. Dies macht es möglich, Veränderungen jeder einzelnen Zelle unter verschiedenen Bedingungen zu verfolgen.

Literaturverzeichnis

Mills, Christopher C., E. A. Kolb, und Valerie B. Sampson. „Entwicklung von Chemotherapien mit Zellzyklus-Inhibitoren für die Therapie von Erwachsenen und Kindern – Kombinationstherapien für Krebs.“ Cancer research 78.2 (2018): 320-325.
Otto, Tobias, und Piotr Sicinski. „Zellzyklus-Proteine als vielversprechende Ziele in der Krebstherapie.“ Nature Reviews Cancer 17.2 (2017): 93-115.
Blagosklonny, Mikhail V. „Die Kraft der chemotherapeutischen Entwicklung: Zellzyklusarrest und Unterdrückung der Seneszenz zum Schutz vor Mitoseinhibitoren.“ Cell cycle 10.14 (2011): 2295-2298.4. Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one
Endo, Kingo, et al. „Nocodazol induziert mitotischen Zelltod mit apoptoseähnlichen Merkmalen in Saccharomyces cerevisiae.“ FEBS letters 584.11 (2010): 2387-2392.
Anda, Teru, Kevin F. Sullivan, und Geoffrey M. Wahl. „Histon–GFP-Fusionsprotein ermöglicht eine empfindliche Analyse der Chromosomendynamik in lebenden Säugerzellen.“ Current Biology 8.7 (1998): 377-385.

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