ANWENDUNGSHINWEIS: Einsatz von Celloger® Mini Plus zur Beobachtung morphologischer Veränderungen und phagozytärer Aktivität in der Makrophagen-Zelllinie

Celloger® Mini Plus Automatisiertes Live-Zell-Bildgebungssystem

Ein integriertes Live-Zell-Überwachungssystem für stabile Bildgebung von Suspensionszellen in der immunologischen Forschung

Da weiße Blutkörperchen, die für die Immunfunktion verantwortlich sind, Suspensionszellen sind, die entlang der Blutgefäße wandern, verwenden immunologische Studien häufig verschiedene Suspensionszelllinien, die von weißen Blutkörperchen stammen. Im Gegensatz zu adhärenten Zellen führt bei Suspensionszellen schon eine leichte Bewegung der Platte beim Platzieren unter dem Mikroskop dazu, dass die Zellen schweben. Abgesehen von Problemen durch Temperatur- und CO₂-Instabilität ist es tatsächlich nicht möglich, ein herkömmliches Mikroskop zur Echtzeitüberwachung der Zellen zu verwenden. Daher ist für eine stabile Überwachung von Suspensionszellen ein Live-Zell-Bildgebungsgerät wie Celloger® Mini Plus, das im Inkubator betrieben wird, unerlässlich¹. Außerdem bewegt sich bei Celloger® Mini Plus die Kamera im System, um Bilder der Zellen an mehreren Positionen aufzunehmen und so die Zellprobe in einem stabilen Zustand zu halten, anstatt eine bewegliche Bühne mit der Platte zu verwenden. Bei der Überwachung von Suspensionszellen sowohl mit Celloger® Mini Plus als auch mit einem Mikroskop war die Bildgebung mit Celloger® Mini Plus stabiler, während beim Mikroskop mehrere Zellen unscharf waren (Abbildung 1).

Abbildung 1. (Rechts) Vorteile der Verwendung von Celloger® Mini Plus bei der Bildgebung von Suspensionszellen.

Bei der Bildgebung von Suspensionszellen mit einem inversen Mikroskop ist Zellfluktuation unvermeidlich, da die Probe aus dem Inkubator genommen, auf die Mikroskopbühne gelegt und bewegt werden muss, um andere Positionen innerhalb der Platte zu lokalisieren. In diesem Prozess werden viele Zellen beobachtet, die vom Boden abheben und unscharf sind (linkes Bild). Andererseits ermöglicht die Bildgebung mit Celloger® Mini Plus den gesamten Bildgebungsprozess im Inkubator. Die Platte ist stabil auf dem Gerät fixiert, und mehrere Positionen innerhalb der Platte können durch Bewegung der Kamera im System abgebildet werden; somit gibt es keine Zellschwebung und keine unscharfen Zellen (rechtes Bild).

Weiße Blutkörperchen als Teil des Immunsystems bekämpfen Infektionen und verteidigen den Körper gegen Fremdstoffe. Ein als angeborene Immunität bekannter erster Abwehrmechanismus erzeugt schnelle Entzündungsreaktionen, um die Ausbreitung und Bewegung fremder Krankheitserreger im Körper sofort zu verhindern. Da die Aktivierung des angeborenen Immunsystems innerhalb von Stunden erfolgt und schnelle Entzündungsreaktionen auslöst, ist es wichtig, die verschiedenen zellulären Abwehrmechanismen in diesem Prozess in Echtzeit zu überwachen. Eine wichtige Funktion der angeborenen Immunität ist die schnelle Rekrutierung von Immunzellen an einen infizierten Bereich. Unter den weißen Blutkörperchen infiltrieren Monozyten das Gewebe und differenzieren sich zu Makrophagen, während sie durch Phagozytose eine Immunantwort gegen eindringende Krankheitserreger auslösen. Wir führten Live-Zell-Bildgebung mit Celloger® Mini Plus (Hellfeld- & grüne Fluoreszenzkanäle, 10X Objektiv) mit der Zelllinie Raw264.7 durch, die die funktionellen Eigenschaften von Makrophagen repräsentiert und für Veränderungen durch Lipopolysaccharid (LPS) bekannt ist².

Als Raw264.7-Zellen durch LPS stimuliert wurden, nahm die Differenzierung der Zellen zu. Die rundlichen und dick kuboiden Zellen in locker haftendem Zustand differenzierten sich, breiteten sich langsam aus und hafteten fester in einer spindelförmigen Gestalt, was durch alle 15 Minuten mit Celloger® Mini Plus (10X Optik) aufgenommene Bilder beobachtet wurde.

Nach der Studie von Saxena et al. (2003) differenzieren Raw264.7-Zellen, die durch LPS stimuliert wurden, zu dendritischen Zellen³. Wir bestätigten durch Echtzeitüberwachung mit EVOM™AutoLCI, dass die Zellen fester hafteten und breiter sowie flacher wurden als die Zellen ohne LPS-Behandlung (Abbildung 2).

Abbildung 2. Überwachung morphologischer Veränderungen in Raw264.7-Zellen mit LPS

Diese morphologische Veränderung war 11 Stunden nach der LPS-Behandlung deutlicher sichtbar und hielt bis zu 22 Stunden an. Außerdem führte die LPS-Stimulation zu Zellproliferation, die durch die Konfluenzanalyse-Funktion von Celloger® Mini Plus quantifiziert wurde (Abbildung 3).

Abbildung 3. Wachstumskurve von LPS-stimulierten Zellen durch Konfluenzanalyse

Durch die Verwendung der Zeitrafferbilder (aufgenommen mit Celloger® Mini Plus, 10X Optik) und die Analyse der Zellkonfluenz mit der AutoLCI-Analyse-App kann ein Zellwachstumsdiagramm erstellt werden.

Es gibt Berichte, dass die durch LPS induzierte Aktivierung von Makrophagen die Phagozytose über den toll-like Rezeptor 4-abhängigen Weg erhöht^2,4. Um dies in Echtzeit zu bestätigen, führten wir Fluoreszenzbildgebung mit fluoreszierenden Latexkügelchen durch, die von Makrophagen aufgenommen wurden. Die 2 µm großen Fluoreszenzkügelchen schwankten leicht bei kleinster Bewegung und schwebten über der Platte. Dies verringert nicht nur die Aufnahmeeffizienz der Kügelchen durch die Zellen, sondern erschwert auch die Bildgebung. Tatsächlich empfehlen selbst kommerzielle Phagozytose-Assay-Kits, nur Zellen mit aufgenommenen Kügelchen mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie nach gründlichem Waschen am Endpunkt zu zählen, um nicht aufgenommene Kügelchen zu entfernen^5,6. In diesem Experiment zeigte die Echtzeit-Bildgebung von Celloger® Mini Plus den gesamten Phagozytoseprozess der Zellen und die Kügelchenaufnahme nur bei den aktivierten Zellen, die durch LPS-Stimulation flach ausgebreitet waren (Abbildung 4A).

Abbildung 4. Phagozytose von LPS-stimulierten Raw264.7-Zellen beobachtet mit Celloger® Mini Plus (Hellfeld- & grüner Fluoreszenzkanal, 10X Optik)

Das Verhalten dieser aktivierten Zellen ist wahrscheinlich möglich, weil sie sich effizient in spindelförmiger Gestalt zu den Kügelchen bewegen, was eine gerichtete Migration im Vergleich zur runden und würfelförmigen Gestalt vor der Differenzierung bewirkt. Es wurde auch in Echtzeit beobachtet, dass die Kügelchen zusammen mit dem Zytoplasma bei der Zellteilung in Tochterzellen aufgeteilt wurden, nachdem die Zellen die Kügelchen aufgenommen hatten (Abbildung 4B).

Es wurde beobachtet, dass die aktivierten Raw264.7-Zellen nach LPS-Stimulation die fluoreszierenden Kügelchen aufnehmen. Zeitrafferbilder wurden im 15-Minuten-Intervall aufgenommen, um die Zellmigration zu den Kügelchen und deren Aufnahme zu beobachten.
Die aufgenommenen Kügelchen innerhalb der Zellen werden während der Mitose zusammen mit dem Zytoplasma in Tochterzellen aufgeteilt.

Darüber hinaus ist es möglich, dynamische Prozessinformationen für verschiedene molekulare Umgebungen durch die einzigartigen Eigenschaften des fluoreszierenden Probes zu erhalten. Wenn ein fluoreszierender Farbstoff zusätzlich zur Hellfeld-Bildgebung aufgenommen werden kann, ist dies für weiterführende vertiefende Studien nutzbar. Mit einem zellimpermeanten Nukleinsäurefarbstoff kann die Zytotoxizität durch die erhöhte Permeabilität des Farbstoffs aufgrund von Membranschäden während der Apoptose bewertet werden⁷. Und insbesondere bei Neutrophilen kann auch die NET-Bildung durch Nukleinsäurefärbung nachgewiesen werden⁸. Außerdem ist es möglich, die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies⁹ in Zellen mit Farbstoffen, die mit reaktiven Sauerstoffspezies reagieren, zu quantifizieren oder die intrazelluläre Ansäuerung im Prozess der Endozytose und Phagozytose mit pH-sensitivem Farbstoff zu beobachten¹⁰.

Die Live-Zell-Bildgebung mit Celloger® Mini Plus ermöglicht hochauflösende Zellbilder, während physikalische Störungen wie Zellschäden oder Vibrationen eliminiert werden. Es ist ein automatisiertes System, das perfekt im Inkubator funktioniert und das ständige Herausnehmen und Wiedereinsetzen des Geräts überflüssig macht. Im Gegensatz zu anderen Geräten hat Celloger® Mini Plus keine bewegliche Bühne, sondern die Kamera im System bewegt sich, um Bilder der Zellen an mehreren Positionen aufzunehmen. Da das Gefäß und die Zellproben in einem stabilen Zustand sind, bietet dies eine stabile Umgebung für das Zellwachstum und erhöht die Erfolgsrate zellbasierter Forschung. Verschiedene Arten von Kulturgefäßen sind mit dem System kompatibel, und es bietet eine hohe Positionsreproduzierbarkeit für stabile Scan-Leistung bei Mehrpunkt-Bildgebung; daher liefert Celloger® Mini Plus verlässliche Ergebnisse in der immunologischen Forschung.

Referenzen

Awasthi, Bhuwan Prasad, et al. (2021) Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry
Wu, Tsu-Tuan et al. (2009) Toxicology letters vol.
Saxena, Rajiv K et al. (2003) Journal of biosciences vol.
Taciak, Bartłomiej, et al. (2018) PloS one
Ariganello, Marianne B., et al. (2018) International journal of nanomedicine
Manda-Handzlik, Aneta, et al. (2018) Immunology and Cell Biology
Riss, Terry, et al. (2019) Assay Guidance Manual [internet]
Takishita, Yutaka, et al. (2019) Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition
Pal, Kunal, et al. (2019) Materials Science and Engineering: C
Diwu, Zhenjun, et al. (1999) Chemistry & biology