ANWENDUNGSHINWEIS: Analyse der durch Nocodazol induzierten Zytotoxizität mit Celloger® Mini Plus

Einleitung

Zytotoxizität bezeichnet das Ausmaß der Schädigung von Zellen, verursacht durch chemische Substanzen oder physikalische Faktoren. Die Messung mittels Zytotoxizitäts-Assay ist für die Arzneimittelentwicklung und biologische Forschung unerlässlich. Zellen durchlaufen komplexe Signalwege, die verschiedene Zellsterbeprozesse wie Apoptose, Nekrose und Nekroptose auslösen. Die meisten Zytotoxizitäts-Assays werden jedoch am Endpunkt gemessen, was es erschwert, die dynamische Reaktion der Zellen auf Medikamente zu untersuchen.

In dieser Anwendungshinweis haben wir die Leistung eines Zytotoxizitäts-Assays mittels Echtzeit-Bildgebung untersucht. Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Nocodazol, dem Krebsmedikament, behandelt wurden, wurden während des Zellsterbens mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt und anschließend mit dem Celloger® Mini Plus überwacht. Durch Zeitrafferaufnahmen wurde beobachtet, dass die Apoptose dosisabhängig mit Nocodazol zunahm, und das Ausmaß der Apoptose wurde quantitativ gemessen und mit der Analyse-Software des Celloger® Mini Plus grafisch dargestellt.

Methode

HeLa-Zellen wurden mit dem Facscope B, einem automatischen Zellzähler, gezählt und mit 1 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung in einer 48-Well-Platte ausgesät. Nach einer Übernachtkultur wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen (16,625 nM, 31,25 nM, 62,5 nM, 125 nM, 250 nM) von Nocodazol behandelt. Zu diesem Zeitpunkt wurde der CellTox Green Farbstoff (Promega, G8742), der an DNA von Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität während des Zellsterbens bindet, zur Probe hinzugefügt. Mit dem im Inkubator installierten Celloger® Mini Plus wurden Zellbilder alle 1 Stunde über 48 Stunden aufgenommen und anschließend mit der Analyse-Software ausgewertet. Die Zellsterberate (%) wurde berechnet als Fluoreszenzabdeckung (= tote Zellen) ÷ Hellfeld-Konfluenz (= Gesamtzellen).

Ergebnisse

Durch die Behandlung der Zellen mit unterschiedlichen Nocodazol-Konzentrationen und die zeitliche Bildgebung veränderte sich die Zellmorphologie konzentrationsabhängig, und eine Schrumpfung der Konfluenz wurde in der Hellfeld-Bildgebung beobachtet (Abbildung 1A, B). Zudem zeigte die Fluoreszenzbildgebung der mit CellTox-Farbstoff gefärbten toten Zellen, die Abdeckung und Quantifizierung des Zellsterbens, dass der Anteil fluoreszierender Zellen mit der Apoptose zunimmt (Abbildung 1C).

Abbildung 1. Analyse des Nocodazol-dosisabhängigen Zellsterbens mittels Zeitraffer-Bildgebung

(A) Zusammengesetzte Hellfeld- und Fluoreszenzaufnahmen für jede Nocodazol-Konzentration.

Die Bilder werden in 24-Stunden-Abständen gezeigt, und grüne Fluoreszenz zeigt die toten Zellen an. (Maßstabsbalken: 200 µm)

(B) Konfluenz (%) der Gesamtzellen über die Zeit.

(C) Graph der Zellsterberate (%) über die Zeit.

Fazit

Der Celloger® Mini Plus ist ein Gerät zur Lebendzellbildgebung, das gleichzeitig Hellfeld- und Fluoreszenzaufnahmen im Inkubator durchführen kann. Das System verfügt über eine voll motorisierte Kamera, die Aufnahmen an verschiedenen Positionen in einem vom Nutzer programmierten Intervall ermöglicht. Die Konfluenzkurve über die Zeit kann durch Berechnung der Konfluenz der aufgenommenen Bilder mit der Analyse-Software gewonnen werden. Darüber hinaus kann durch Messung der Fluoreszenzabdeckung das Ausmaß der Apoptose in Abhängigkeit von der Nocodazol-Konzentration quantifiziert werden.

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