自動TEER測定

小腸（SMI）上皮細胞は、IRB承認後に死後ドナーから採取されました。SMI細胞は、PermaCell™ 高孔密度（0.4µm、1.0×10^8孔/cm²）PET膜細胞培養用96ウェルプレート（MatTek Life Sciences；アシュランド、MA）に播種され、気液界面（ALI）に上げられ、分化誘導用に特別に調整された培地で2週間培養されました。PermaCell™ 96ウェルシステムの画像と、EpiIntestinal™ 組織モデルの代表的なH&E染色断面図は図1A-Dに示されています。

図1–96ウェル高スループットPermaCellプレートで培養されたEpiIntestinal組織のTEER測定。A）プレートカバー。B）底部に0.4µm膜を持つインサートプレート。C）リザーバープレート。D）96ウェルインサートプレートで培養されたEpiIntestinal™組織のH&E染色断面。E）TEER電極を示す100mM KClで満たされたインサートおよびボトムプレートの断面。

TEER測定の前に、EpiIntestinal™組織は無菌の100 mM KCl（頂側150 µL、底側400 µL）に移されました。TEERは、STX HTS EVOM™電極とEVOM™マニュアルを用いた手動測定と、EVOM™ Auto自動TEER測定システム（World Precision Instruments, LLC, Sarasota, Florida）を用いた自動測定の両方で行われました。EVOM™ Auto 96 HTS電極の位置を示すPermacell™ 96ウェルシステムの模式図は図1Eに示されています。STX HTS EVOM™電極を用いたEVOM™マニュアルとEVOM™ Autoシステムの比較は図2A-Bに示されています。自動測定は、1ウェルあたり2秒の読み取り時間で行われました。TEER計算の前に、組織サンプルの抵抗値は、96トランスウェルアセンブリの受容プレート内の空白100 mM KClバッファの抵抗値を用いて背景補正されました。

図2–EVOM™ Autoは高スループットのTEER測定を可能にします。A) 96ウェルトランスウェルプレートでのSTX HTS電極付きEVOM™マニュアルは、96サンプルの測定に24分3秒かかります。B) 96ウェルプレートでのTEER自動測定用EVOM™ Autoシステムは、96サンプルの読み取りにわずか4分10秒しかかかりません。

試験物質に曝露する前に、上記の方法に従って組織バリア機能（TEER）の基準値測定を行いました。短時間（3時間）のエチレングリコール四酢酸（EGTA）曝露は、10mM HEPESを含む1Xハンクス緩衝塩溶液（HBSS）をアピカル面に適用する形で行いました。長時間（6日間）のデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）曝露は、アピカルおよびバソラテラルの両コンパートメントの培養液にDSSを添加して実施しました。TEERで評価した可逆的な組織損傷は、それぞれの対照用溶媒組織に対する相対値で示しています。

組織サンプルは10%ホルマリンで3時間固定され、0.1%トリトンX-100を含む1Xトリス緩衝生理食塩水（TBS）で30分間透過処理され、10%ノーマルヤギ血清を含む1X TBSで2時間ブロックされました。モノクローナル組換えウサギ抗クローディン1抗体（Abcam カタログ番号 ab211737、ケンブリッジ、MA）は1:1,000に希釈され、室温で優しく攪拌しながら2時間インキュベートされました。ヤギ抗ウサギIgG（H+L）二次抗体、Alexa Fluor™ 555（ThermoFisher カタログ番号 A21429、ウォルサム、MA）は1:400に希釈され、室温で優しく攪拌しながら1時間インキュベートされました。核は4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で対染色されました。画像はオリンパスFV1000共焦点顕微鏡を用いて、2X対物レンズおよび40X油浸対物レンズの両方で取得されました。免疫組織化学染色の代表画像は、EGTAおよびDSS曝露に対してそれぞれ図3Dおよび図4Dに示されています。

図3–EpiIntestinal™組織モデルは、EGTAに30時間曝露後および曝露後48時間のインキュベーション後に完全回復を示します。A) TEER測定。B) ルシファーイエロー（LY）透過性。C) LYの見かけの透過係数。計算式：、ここでΔQ/Δtは経過時間後の基底側コンパートメントに存在するLYの濃度、Vrは基底側コンパートメントの受容バッファーの体積、Aは組織の表面積、Cは組織の頂側表面に適用された初期LY濃度です。D) バリアタンパク質クローディン1（赤）の免疫染色、DAPI（シアン）で対染色。誤差棒＝標準偏差。図4 – デキストラン硫酸ナトリウム塩（DSS）に6日間曝露し、その後6日間のインキュベーションを行ったEpiIntestinal組織モデルへの影響。A) TEER測定。B) ルシファーイエロー（LY）透過性。C) LYの見かけの透過係数。計算式：P app= ∆Q/∆t × Vr/(A*C)、ここで∆Q/∆tは経過時間後の基底側コンパートメントに存在するLYの濃度、Vrは基底側コンパートメントの受容バッファーの体積、Aは組織の表面積、Cは組織の頂側表面に適用された初期LY濃度です。D) バリアタンパク質クローディン1（赤）の免疫染色、DAPI（シアン）で対染色。誤差棒＝標準偏差。

組織は10mM HEPESおよび1.98g/Lのグルコースを含む1X HBSS 250µLに移され、同じバッファー中の100µM LY染料50µLが頂端面に適用されました。基底側受容液（RS）は2時間の間、30分ごとに交換されました。各RSサンプルから100µLを取り、各時間点でのRS中のLY濃度を測定しました。RSサンプルはSpectramax M2プレートリーダー（Molecular Devices, サンノゼ, CA）を用いて、励起波長帯445-455nm、蛍光波長帯518-538nm、感度設定145で読み取りました。

図5–96ウェルPermaCellプレートで培養されたEpiIntestinal™組織のTEER測定は、EVOM™ Auto測定システムを使用した場合の方がEVOM™ Manualよりも一貫性が高く、測定時間も大幅に短縮されて使いやすくなっています。A) EVOM™ Autoの測定値はより再現性が高く、プレートの測定時間はEVOM™ Manualに比べて劇的に短縮されました。B) EVOM™ ManualのTEER値は測定期間中に安定性が低く、手動測定中にやや増加しました（p