Organ-on-Chipプラットフォームにおけるバリア完全性の定量化
EVOM™ Chipプラットフォームは、高忠実度かつリアルタイムのTEER測定を実現し、内皮モデルおよびBBBモデルにおけるバリア成熟と炎症性破綻を明らかにします。これにより、微小生理学的システムにおけるバリア機能を、標準化されたスケーラブルな方法で評価できます。
要旨
バリア完全性をリアルタイムかつ定量的に評価することは、in vitroで神経血管生理および血液脳関門（BBB）機能をモデル化するうえで基盤となります。本研究では、EVOM™ Chipプラットフォームを用いて、血管内皮モデルおよび初代BBB三重共培養モデルにおける経内皮電気抵抗（TEER）をモニタリングしました。TEER測定により、時間経過に伴う強固なバリア形成が示され、さらに炎症促進性サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）への曝露後に、顕著なバリア破綻が検出されました。これらの結果は、EVOM™ Chipプラットフォームが、高感度で標準化されたスケーラブルなソリューションとして、先進的な細胞培養モデルにおける微細なバリア動態と炎症応答を明らかにできることを示しています。
はじめに
血管内皮やBBBなどのバリア形成組織は、分子交換と組織恒常性を厳密に調節しているため、その完全性は疾患モデル、創薬、毒性試験における重要な評価指標です。TEERは、バリア形成の定量化とバリア破綻の検出に広く用いられている非侵襲的な方法です。EVOM™ Chipプラットフォームは、微小生理学的システム形式に埋め込み電極を統合し、高感度で再現性の高いTEER測定を実現します。これにより手動操作に伴うばらつきを排除し、継続的かつハンズフリーでモニタリングできます。EVOM™ Chipは、細胞バリア動態に関するリアルタイムで高忠実度の知見を提供するとともに、TEER測定の標準化された手法を確立します。
本アプリケーションノートでは、 EVOM™ Chipプラットフォームを用いて以下を実施する方法を示します。
- ハンズフリーかつマルチプレックス対応のオンチップTEER測定により、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）単層培養における内皮バリアの成熟をモニタリングする。
- SynBBBプラットフォーム上の初代三重共培養モデルにおけるBBB形成を評価する。
- TEERを機能的破綻の指標として用い、サイトカイン誘導性の炎症性バリア破綻を定量化する。
材料と方法
HUVECをEVOM™ Chipデバイス上で培養し、48時間にわたってバリア形成をモニタリングしました。内皮細胞、アストロサイト、ペリサイトからなる初代BBBモデルを構築し、バリアの形成と成熟を促進するため72時間培養しました。バリア形成後、培養物をTNF-α（10 ng/mL）で処理してバリア破綻を誘導しました。バリア完全性は、細胞バリアを挟む電気抵抗を測定し、EVOM™ Chipプラットフォーム上でTEERを定量することにより評価しました。
統計解析
データは平均値 ± SEMで示しました。HUVEC単層培養、n = 7；SynBBB三重共培養、n = 15。一元配置分散分析（ANOVA）と多重比較を用いて統計的有意性を評価しました。有意水準はp < 0.05としました。有意水準：*** p < 0.001；**** p < 0.0001。
結果
A. EVOM™ ChipによるHUVECバリア形成とサイトカイン介在性破綻の定量。ベースラインの抵抗値は平均約15 kΩでした。48時間の培養後、TEERは約36 kΩまで有意に上昇し、密な内皮バリアが正常に形成されたことを示しました。TNF-α（10 ng/mL）に4時間曝露すると、抵抗値は約29～30 kΩまで低下し、バリア完全性の測定可能な損失が示されました。
- 単層の成熟中にTEER値は2倍以上に上昇し、高完全性の内皮バリアが迅速に形成されたことを反映しました。
- TNF-α曝露によりTEERは急速かつ定量的に低下し、急性炎症性バリア破綻を明らかにするプラットフォームの能力が示されました。
- サンプルサイズが小さいにもかかわらず、すべての実験群間で統計的に有意な差が観察されました（n=7、***p < 0.001、****p < 0.0001）。
図1 EVOM™ Chipプラットフォーム上のHUVEC単層培養
B. EVOM™ Chipによる複雑なBBB形成と損傷の定量。SynBBBプラットフォームを用いて初代三重共培養BBB細胞を増殖させたところ、TEERはベースラインの約14～15 kΩから、72時間の培養後には約25～26 kΩまで上昇し、段階的なバリア成熟が示されました。TNF-α曝露後、抵抗値は約21～22 kΩまで低下し、BBB完全性の破綻が示されました。
- 初代三重共培養モデルでは、72時間にわたって生理学的に妥当なBBB強化が示され、内皮細胞・アストロサイト・ペリサイト間の協調的相互作用と一致しました。
- サイトカイン刺激によりTEERは明確に低下し、炎症ストレスに対するモデルの応答性と、微細なBBB変化に対するプラットフォームの感度が確認されました。
- すべての時点間で統計的に有意な差が観察されました（n=15、***p < 0.001、****p < 0.0001）。
考察
バリア完全性を正確かつ定量的に測定することは、血管生物学の研究や神経血管疾患の機序のモデル化に不可欠です。WPIの埋め込み電極構造によりTEERをオルガン・オン・チップシステムへ直接統合することで、従来のハンドヘルドプローブに対する大きな利点が得られます。従来のプローブは手動での位置決めが必要で、操作者によるばらつきを生じさせ、測定のたびに培養条件を乱します。埋め込み電極はデバイス内に固定されるため、電極形状を一定に保ちながら、連続的でハンズフリーかつ非侵襲的なモニタリングと、優れた信号安定性を実現します。これはバリア機能の微細な変化を明らかにするうえで重要です。内皮単層培養と三重共培養のいずれにおいても、このアプローチはバリア成熟時の明確なTEER上昇と、炎症刺激後の急速な低下を捉え、リアルタイムの機能的評価指標としてTEERを組み込む重要性を示しました。TEER測定を培養プラットフォームに直接組み込むことで、データ品質の向上、再現性の改善、生物学的または薬理学的刺激に対するバリア動態のより正確な解釈が可能になります。
本研究では、EVOM™ ChipがSynBBBマイクロ流体チップ上の単層および三重共培養細胞モデルの双方で、バリア成熟を反映するTEER上昇を高感度に検出できること、さらにサイトカインによる炎症応答の誘導とBBB損傷の影響を定量化できることを示しました。両モデルにおいて、TNF-α処理後にTEERの低下が観察され、タイトジャンクション構造のサイトカイン介在性破綻とバリア透過性の増加と一致しました。
これらの結果は、EVOM™ Chipプラットフォームが、さまざまなin vitroモデルにおけるバリア動態のモニタリングに適した、高感度で再現性の高い非侵襲的方法を提供することを示しています。この技術は、臓器特異的なバリアモデルにおけるTEERベースの評価指標を標準化する基盤となり、脳、肝臓、腎臓、腸管などを対象とした薬物スクリーニング、機序研究、疾患モデリングへの応用を可能にします。
これらの結果により、EVOM™ Chipプラットフォームが、内皮単層培養およびBBB三重共培養におけるバリア形成とサイトカイン誘導性バリア機能障害の双方を高感度に検出できることが確認されました。
