Organ-on-Chipプラットフォームにおけるバリア完全性の定量化
EVOM™ Chipプラットフォームは、内皮モデルとBBBモデルにおけるバリア成熟と炎症による損傷を捉える、高精度なリアルタイムTEER測定を実現し、マイクロ生理学的システムにおけるバリア機能の標準化された拡張性の高い評価を可能にします。
要旨
バリア完全性をリアルタイムで定量的に評価することは、神経血管生理と血液脳関門（BBB）のin vitroモデル化の基盤となります。本研究では、EVOM™ Chipプラットフォームを用いて、血管内皮モデルと初代BBB三種共培養モデルの両方で経内皮電気抵抗（TEER）をモニタリングしました。TEER測定により、時間の経過に伴う堅牢なバリア形成が示され、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）への曝露後に有意なバリア損傷が検出されました。これらの結果は、先進的な細胞培養モデルにおける微細なバリア動態と炎症応答を評価するための、高感度で標準化され、拡張性に優れたソリューションとして、EVOM™ Chipプラットフォームの有用性を示しています。
はじめに
血管内皮やBBBなどのバリア形成組織は、分子交換と組織の恒常性を厳密に制御するため、その完全性は疾患モデリング、創薬、毒性試験における中心的な評価指標となります。TEERは、バリア形成の定量化とバリア損傷の検出に広く用いられている非侵襲的な方法です。EVOM™ Chipプラットフォームは、マイクロ生理学的システムに組み込み電極を統合し、高感度で再現性の高いTEER測定を実現します。これにより手動操作によるばらつきがなくなり、継続的なハンズフリーモニタリングが可能になります。EVOM™ Chipは、細胞バリアの動態に関する高精度なリアルタイムの知見を提供するとともに、TEER測定の標準化された手法を確立します。
本アプリケーションノートでは、EVOM™ Chipプラットフォームの次の用途を紹介します。
- ハンズフリーのオンチップTEER多重測定により、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）単培養における内皮バリアの成熟をモニタリングする。
- SynBBBプラットフォーム上の初代三種共培養モデルでBBBの発達を評価する。
- TEERを機能的なバリア損傷の指標として用い、サイトカインによる炎症性バリア損傷を定量化する
材料と方法
HUVECをEVOM™ Chipデバイス上で培養し、48時間にわたってバリア形成を観察した。内皮細胞、アストロサイト、周皮細胞からなる初代BBBモデルを構築し、バリアの発達と成熟を促すため72時間培養した。バリア形成後、培養細胞にTNF-α（10 ng/mL）を処理してバリアの破綻を誘導した。EVOM™ Chipプラットフォーム上で細胞バリアを横切る電気抵抗を測定し、TEERを定量することでバリアの完全性を評価した。
統計解析
データは平均値 ± SEMで示す。HUVEC単層培養、n = 7；SynBBB三重培養、n = 15。統計的有意性の評価には、多重比較を伴う一元配置ANOVAを用いた。有意水準はp < 0.05とした。有意水準：*** p < 0.001；**** p < 0.0001。
結果
A. EVOM™ ChipによるHUVECバリア形成とサイトカインを介した破綻の定量。ベースラインの抵抗値は平均約15 kΩだった。培養48 -時間後、TEERは約36 kΩまで有意に上昇し、緊密な内皮バリアの形成が確認された。TNF-α（10 ng/mL）に4 -時間曝露すると、抵抗値は約29～30 kΩに低下し、バリアの完全性が測定可能なほど損なわれたことが示された。
- 単層の成熟に伴いTEER値は2倍以上に上昇し、高い完全性を備えた内皮バリアが速やかに形成されたことを反映していた。
- TNF α曝露によりTEERが急速かつ定量可能な形で低下し、急性炎症によるバリア破綻を検出するプラットフォームの能力が示された。
- サンプルサイズが小さいにもかかわらず、すべての実験群間で統計的に有意な差が認められた（n=7、***p < 0.001、****p < 0.0001）。
図1 EVOM™ Chipプラットフォーム上のHUVEC単層培養
B. EVOM™ Chipによる複雑なBBB形成と損傷の定量。 SynBBBプラットフォームを用いて初代三重培養BBB細胞を培養したところ、バリアが徐々に成熟し、TEERはベースラインの約14～15 kΩから培養72- -時間後には約25～26 kΩに上昇した。TNF-α曝露後、抵抗値は約21～22 kΩに低下し、BBBの完全性が損なわれたことを示した。
- 初代三重培養モデルでは、72時間にわたり生理学的に妥当なBBBの強化が認められ、内皮細胞、アストロサイト、周皮細胞の協調的な相互作用と一致していた。
- サイトカイン負荷によりTEERが明確に低下し、炎症ストレスに対するモデルの応答性と、BBBの微細な変化に対するプラットフォームの感度が確認された。
- すべての時点間で統計的に有意な差が認められた（n=15、***p < 0.001、****p < 0.0001）。
考察
血管生物学の研究や神経血管疾患の機序のモデリングには、バリアの完全性を正確かつ定量的に測定することが不可欠です。WPIの電極埋め込み構造により、臓器チップシステムにTEERを直接統合することで、従来のハンドヘルドプローブに比べて大きな利点が得られます。従来のプローブでは手動での位置合わせが必要で、操作者によるばらつきが生じ、測定のたびに培養条件が乱されます。埋め込み電極はデバイス内で固定されるため、電極配置の一貫性と優れた信号安定性を保ちながら、ハンズフリーで連続的かつ非侵襲的にモニタリングできます。これは、バリア機能の微細な変化を捉えるうえで重要です。内皮細胞の単培養と3種細胞共培養のどちらでも、この方法によりバリア成熟に伴う明確なTEERの上昇と、炎症刺激後の急速な低下を捉えられ、リアルタイムの機能的指標としてTEERを取り入れる重要性が示されました。培養プラットフォームにTEER測定を直接組み込むことで、データ品質と再現性が向上し、生物学的刺激や薬理学的刺激に対するバリア動態をより正確に解釈できます。
ここでは、EVOM™チップが、SynBBBマイクロ流体チップ上の単培養および3種細胞共培養モデルの両方で、バリア成熟を反映するTEERの上昇を高感度に検出するとともに、サイトカインが炎症反応を誘発してBBBを損傷する効果を定量化できることを示します。 どちらのモデルでも、TNF-α処理後にTEERの低下が観察され、サイトカインを介したタイトジャンクション構造の破壊とバリア透過性の上昇に一致していました。
これらの結果は、EVOM™チッププラットフォームが、さまざまなin vitroモデルにおけるバリア動態をモニタリングするための、高感度で再現性の高い非侵襲的な方法を提供することを示しています。この技術は、臓器特異的バリアモデル全体で標準化されたTEERベースの測定値を得るための基盤を確立し、薬物スクリーニングへの応用を可能にします[i以下を含む、
これらの知見は、EVOM™チッププラットフォームが、内皮細胞の単培養およびBBBの3種細胞共培養におけるバリア形成と、サイトカイン誘発性のバリア機能障害の両方を高感度に検出できることを確認しています。
