TEER測定に関するよくある質問

TEER測定に関するよくある質問（FAQ）を、EVOM2を使った方法についてご紹介します。

著者：Subhra Nag, PhD

電気抵抗と経上皮電気抵抗（TEER）は同じものですか？

いいえ。TEER値は、上皮電圧計（例えばEVOM2）で得られた生の抵抗値に、細胞培養インサート上に成長した細胞の成長面積（例：単層細胞の面積）を掛けて算出します。

例えば、0.5 cm²の面積の細胞培養インサート上に細胞を培養した場合、

上皮電圧計（例：EVOM2）での抵抗値が300 Ωと読み取れたとします。

TEER= 300 Ω × 0.5 cm² = 150 Ω・cm²

EndOhmとは何ですか？

EndOhmは、EVOM2用に設計されたチャンバーで、取り外し可能なウェルをセットして抵抗測定を行います。このチャンバーは電極が固定位置にあり、電極の位置と安定性が組織抵抗の測定に大きく影響します。

EVOM2はどのようにしてコンフルエンス（細胞密度）を測定しますか？

EVOM2は、まず「ブランク」ウェルの抵抗を測定します。この最初の抵抗値には電極抵抗、電極間隙、液体培地の体積とモル濃度による抵抗が含まれます。（電極の電荷差は、EVOM2の極性を反転させて平均化する測定方法により打ち消されます。）その後の定期的な測定は、抵抗値の変化として膜の成長を示し、抵抗値が安定した段階で膜がコンフルエント（密着）したと判断します。EVOM2システムは、電圧クランプアンプやUssingシステムと同様の原理で動作しますが、特別なUssingチャンバーは不要です。EVOM2はUssingほど正確ではありませんが、膜がコンフルエントかどうかを判断する目的で使用されます。（膜の透過性解析も一部可能ですが、絶対値ではなく変化率としての解析となります。）

なぜSTXではなくEndOhmを使うのですか？

EVOM2は、電気が最も抵抗の低い経路を通るため、膜のピンホールや空隙を検出しやすいです。STX2の汎用電極は曲がりやすく電極間隔が変わることがあり、またウェル内で固定しないため抵抗誤差が大きくなります。一方、EndOhmの電極は固定されており、適切に管理し培地で前処理すれば最も安定し再現性の高い抵抗値が得られます。中心に同心円状の電極が配置されているため、膜全体に電流が均一に流れ、STX2のような端部配置による影の部分ができません。（なお、組織の基準TEER値が低い場合、大面積膜での測定は困難になることがあります。例えば、TEER値が200Ω・cm²の場合、12mmウェルでは同じコンフルエント測定で1.13倍低い176.9Ω、24mm径ウェルでは4.52倍低い44.2Ωとなります。抵抗値が約100Ω以下になると電極の不安定性が増し、測定値が変動しやすくなります。電極の「洗浄」や前処理が安定した測定には不可欠です。）

電極の洗浄方法は？

電極の洗浄は、定期的に酵素洗浄剤（Enzol、Tergazyme）を使用するか、無香料の家庭用漂白剤（3% NaClO）に浸す方法があります。漂白剤は銀表面をAgClに再コーティングし、蓄積したタンパク質を溶解します。これらの汚れは電極の不安定化を招きます。酵素洗浄剤は、DMEMなどの培地成分による電極表面の残留物を安全に除去します。汚れが蓄積すると抵抗値が上昇し、不安定になります。

電極の前処理とは？

電極の前処理は、測定に用いる培地に電極を事前に浸すことで、電極内の透過性ペレットから異物が移動するのを促します。アルコールは電極の滅菌に使われますが、電極に浸透し電気抵抗が高くなります。アルコールが培地と置換されるにつれて、抵抗値は徐々に低下していきます。

TEER測定用の簡単なデータ取得システムはありますか？

Lab-Trax-4は静音の12ビット4チャンネルアナログ-デジタルデータレコーダーで、最大10,000サンプル/秒（4チャンネル合計で2,500サンプル/秒）のサンプリング速度を持ちます。USB2ポートから直接給電され、ノートパソコンと組み合わせてフィールドでの携帯使用が可能です。デジタル入力4つ、出力4つも備えています。

LabScribe3ソフトウェアは使いやすく、最新の要求に応じて頻繁に更新されています。Microsoftの新OSへの対応も継続されており、MacやLinuxでもサポートされています。STX2を使う場合は、テキスト入力に手が必要になることがあります。測定前にMarksフィールドにテキストを入力しておけば、TEER値が安定した時にEnterキーを押すだけでマークを付けられます。STX100を使う場合は手が自由になるため、メモを取りやすいです。

TEER測定でよくある課題は何ですか？

以下はSTX2に関する内容ですが、EndOhmにも当てはまります。

以下の要因が抵抗値の変動を引き起こします：

電極間隔の変化。STX2電極の間隔を広げたり狭めたりしないでください。
電極抵抗。電極は清潔に保ち、前処理を行ってください。
電極の深さ。電極は常に少なくとも2mm沈めてください。
電極がプラスチック壁に近い位置。可能な限りプレートの壁から離して設置してください。
電極の設置位置。通常、長い脚を底面に置く場合は、毎回同じ位置に置いて一貫性を保ってください。
液体の抵抗。培地の蒸発や希釈は避けてください。
液面の高さ。毎回同じ液量を保つようにしてください。小さな変化でも小さなインサートでは大きな影響があります。
過度の動き。電極はできるだけ動かさずに保持してください。場合によっては機械的な電極ホルダーを使用してください。
洗浄や培地交換時に細胞培養インサートの膜が破れることがあります。液体交換はインサートの壁に沿って慎重に行ってください。膜から細胞層が少し剥がれると、電流が膜を通らず隙間を通って流れ、抵抗値が大幅に低下します。抵抗値が急激に下がった場合は、顕微鏡でサンプル（細胞単層）を確認し、フィルターの破損や細胞の剥離がないか調べてください。

同じウェルで複数回（3～5回）測定し平均を取ることで変動を減らせます。

安定したTEER結果を得るために制御すべき実験条件は？

温度はTEER値に影響します。一定の温度を保つことを推奨します。測定は細胞培養培地やバッファー中で行うため、実験中に使用する培地やバッファーは一定温度に保つために水浴を使用してください。細胞培養インサートを含むウェルプレートは、測定前にインキュベーターから取り出し、室温で少なくとも20分間安定させてから測定してください。
EndOhmチャンバーを使用する場合は、上下電極間の距離を一定に保ってください。STX2電極を使う場合は、垂直に保持し、同じ持ち方で測定することで一貫した結果が得られます。
上側（細胞培養インサートの上部）と下側（12ウェルプレートのウェル内）で同じイオン濃度の液体を使用してください。例えば、上側に1X PBSバッファーを使う場合は、下側にも1X PBSバッファーを使用します。また、液面の高さを同じにして圧力差を最小限にしてください。実験中は膜の剥離を防ぐため、まず上側のウェルに液体を入れてから下側に注ぎます。
すべての実験で同じ液量を使用することでデータのばらつきを減らせます。

上側に培地を入れずに培養した肺胞上皮細胞のTEERを測定したい場合、上側に培地やバッファーを加える必要がありますか？

はい。簡単に言うと、電極（EndOhmやSTX2）は液体（細胞培養培地やバッファー）を介して電気的接続を維持しています。上側に液体がないと電気的接続が途切れます。ただし、上側に培地を入れずに培養した細胞の場合は、上側の液体への曝露時間をできるだけ短くすることを推奨します。約5分間の曝露であれば細胞に影響はないと考えられます。曝露可能な時間を確認するためにパイロット実験を行うことをお勧めします。前述の通り、上側と下側で同じイオン濃度の液体（例：1X PBSバッファーや培地）を使用してください。

詳細はEVOM2によるTEER測定の記録をご覧ください。

注意：EVOM2はEVOM™ Manualに置き換えられ、Ussingシステムは廃止されました。