TEER測定に関するよくある質問

TEER測定に関するよくある質問（FAQ）をEVOM2を使った方法でご紹介します。

電気抵抗と経上皮電気抵抗（TEER）は同じものですか？

いいえ。TEER値は、上皮ボルトメーター（例えばEVOM2）で得られた生の抵抗値に、細胞の成長面積（例：細胞培養インサート上に成長した単層細胞の面積）を掛けて算出します。

例えば、0.5 cm²の面積の細胞培養インサート上に細胞を培養した場合。

上皮ボルトメーター（例：EVOM2）の抵抗値は300 Ωと表示されます。

TEER= 300 Ω × 0.5 cm² = 150 Ω・cm²

EndOhmとは何ですか？

EndOhmは、EVOM2用に設計されたチャンバーで、取り外し可能なウェルをセットして抵抗測定を行います。このチャンバーは電極が固定位置にあり、電極の位置と安定性が組織抵抗の測定に大きく影響します。

EVOM2はどのようにしてコンフルエンスを測定しますか？

EVOM2は、まず「ブランク」ウェルの抵抗を測定します。この最初の抵抗値には電極抵抗、電極間隙、液体培地の体積とモル濃度による抵抗が含まれます。（電極の電荷差は、EVOM2の極性を反転させて平均化する測定方法により打ち消されます。）その後の定期的な測定は、抵抗値の変化として膜の成長を示し、抵抗値が安定した段階で膜がコンフルエントに達したと判断します。EVOM2システムは電圧クランプアンプやUssingシステムと同様に動作しますが、特別なUssingチャンバーは不要です。EVOM2はUssingほど正確ではありませんが、膜がコンフルエントかどうかを判断する目的で使用されます。（膜の透過性解析も一部可能ですが、絶対値ではなく変化率としての解析となります。）

なぜSTXではなくEndOhmを使うのですか？

EVOM2は、電気が最も抵抗の低い経路を通るため、膜のピンホールや空洞を検出します。STX2の汎用電極は曲がりやすく電極間隔が変わることがあり、またウェル内で固定しないため抵抗誤差が大きくなります。一方、EndOhmの電極は固定されており、適切に管理し培地で前処理すると最も安定し再現性の高い抵抗測定が可能です。中心に同心円状の電極が配置されているため、膜全体に電流が均等に流れ、STX2のような端部配置による影の部分がありません。（なお、組織の基準TEER値が低い場合、大面積膜での測定は困難になることがあります。例えば、TEER値が200Ω・cm²の場合、12mmウェルでは同じコンフルエント測定で1.13倍低く（176.9Ω）、24mm直径ウェルでは4.52倍低く（44.2Ω）なります。抵抗値が約100Ω以下になると電極の不安定性が増し、測定値が変動しやすくなります。電極の「洗浄」と前処理は安定した測定に不可欠です。）

電極の洗浄方法は？

電極の洗浄は、定期的に酵素洗浄剤（Enzol、Tergazyme）を使用するか、無香料の家庭用漂白剤（3% NaClO）に浸す方法があります。漂白剤は銀表面をAgClに再コーティングし、蓄積したタンパク質を溶解します。これらの効果により電極の不安定性が軽減されます。酵素洗浄剤は、DMEMなどの培地成分による電極表面の残留物を安全に除去します。残留物が蓄積すると抵抗値が上昇し、不安定になります。

電極の前処理とは？

電極の前処理は、測定培地に電極を事前に浸して、異物液体が透過性ペレットから移動するのを促すことです。アルコールは電極の滅菌に使われますが、電極に浸透し電気抵抗が高くなります。アルコールが生理食塩水ベースの培地と徐々に置換されると、抵抗値は徐々に低下していきます。

TEER用の簡単なデータ取得システムはありますか？

Lab-Trax-4は静音の12ビット4チャンネルアナログ-デジタルデータレコーダーで、最大10,000サンプル/秒（4チャンネル合計で2500 s/S）のサンプリング速度を持ちます。USB2ポートから直接給電され、フィールドでのノートパソコン使用に適した携帯型ユニットです。デジタル入力4つ、デジタル出力4つも備えています。

LabScribe3ソフトウェアは使いやすく、最新の要求に応じて頻繁に更新されています。Microsoftの新しいOSへの対応も継続されており、MacやLinuxでもサポートされています。STX2を使う場合は、テキスト入力のためにもう一人手が必要かもしれません。測定前にMarksフィールドにテキストを入力しておけば、TEER値が安定した時にEnterキーを押すだけでマークを付けられます。STX100を使う場合は手が自由になるため、メモを取りやすいです。

TEER測定でよくある課題は何ですか？

これはSTX2に関する内容ですが、EndOhmにも当てはまります。

以下の要因が抵抗値の変動を引き起こします：

電極間隔。STX2電極の間隔を広げたり圧縮したりしないでください。
電極抵抗。電極は清潔に保ち、前処理を行ってください。
電極の深さ。電極は常に少なくとも2mm沈めてください。
電極がプラスチック壁の近くにある場合。可能な限りプレートの壁から離してください。
電極の設置位置。通常、長い脚を底面に置く場合は、測定ごとに同じ位置に置いてください。
液体の抵抗。培地の蒸発や希釈は避けてください。
液面の高さ。測定ごとに同じ液量を維持してください。小さな変化でも小さなインサートでは大きな影響があります。
過度の動き。電極はできるだけ動かさずに保持してください。場合によっては機械的な電極ホルダーを使用してください。
洗浄や培地交換時に細胞培養インサートの膜が破れることがあります。液体交換はインサートの壁に沿って慎重に行ってください。膜や細胞層が少しでも剥がれると、EVOM2はその隙間を通る電流を低抵抗経路として読み取り、抵抗値が大幅に低下します。抵抗値が急激に下がった場合は、顕微鏡でサンプル（細胞単層が培養されたインサート）を確認し、フィルターの破損や細胞の剥離がないか調べてください。

同じウェルで複数回（3～5回）測定し平均を取ることで変動を減らせます。

安定したTEER測定のために制御すべき実験条件は？

温度はTEER値に影響します。一定の温度を保つことを推奨します。測定は細胞培養培地やバッファー中で行うため、実験中は一定温度の水浴で培地やバッファーを温めてください。培養インサート上に細胞が成長したウェルプレートは、測定前にインキュベーターから少なくとも20分間室温に置いて安定させることを推奨します。
EndOhmチャンバーを使う場合は、上下電極間の距離を一定に保ってください。チョップスティック型電極（STX2）を使う場合は、垂直に保持し、同じ持ち方で測定を行うことで安定した結果が得られます。
アピカル側（例：細胞培養インサートの上部）とバソラテラル側（例：12ウェルプレートのウェル内のインサート下部）で同じイオン濃度の液体を使うことを推奨します。測定中にアピカル側に1X PBSバッファーを使う場合は、バソラテラル側にも1X PBSバッファーを使ってください。また、液面の高さを同じにして圧力差を最小限にしてください。実験中は膜の剥離を防ぐため、まずアピカル側に液体を注ぎます。
すべての実験で同じ量の液体（培地やバッファー）を使用することでデータのばらつきを減らせます。

アピカル側に培地を使わずに培養した肺胞上皮細胞のTEERを測定したい場合、アピカル側に培地やバッファーを加える必要がありますか？

はい。簡単に言うと、電極（EndOhmやSTX2など）は液体（細胞培養培地やバッファー）を介して電気的接続を維持しています。アピカル側に液体がないと電気的接続が途切れます。ただし、アピカル側に培地を使わず培養した細胞の場合は、アピカル側の液体への曝露時間をできるだけ短くすることを推奨します。約5分間の曝露であれば細胞に影響はないと考えられます。曝露可能な時間を確認するためにパイロット実験を行うことをお勧めします。前述の通り、アピカル側とバソラテラル側の両方で同じイオン濃度の液体（例：1X PBSバッファーや培地）を使うことを推奨します。

詳細はEVOM2によるTEER測定の記録をご覧ください。

注意：EVOM2はEVOM™ Manualに置き換えられ、Ussingシステムは廃止されました。