アプリケーションノート：TEER技術が創薬のための最適化されたin vitroワークフローを実現

血管作動性物質を同定するための最適化されたin vitroワークフロー

in vitroモデルでは、内皮バリアの完全性の変化を定量化するために、2つの一般的な方法が用いられています：経上皮/経内皮電気抵抗（TEER）とトレーサー化合物の透過性です。¹ TEERは、非侵襲的に電気伝導度の変化を定量化し、細胞の密着度とバリアの完全性を測定する方法です。トレーサー化合物の透過性は、分子量が定義された分子（例：4 kDa FITC-デキストランまたはFD4）を用いて細胞バリアのサイズ排除能力を測定します。¹ EVOM™ Manual（EVOM-MT-03-01）とEndOhm TEER電極および細胞培養用透過性サポートを使用し、本アプリケーションノートではサイトカイン処理後の内皮バリアの完全性を非侵襲的に評価する方法と、血管損傷を誘発する可能性のある血管作動性化合物を同定する方法を説明します。トレーサー化合物の透過性試験はTEER評価と組み合わせて、細胞間接合部および細胞間輸送に対する処理の影響を明らかにします（図1）。

図1– TEERおよびトレーサー透過性アッセイを用いた内皮活性化測定のワークフロー。

薬物誘発性血管損傷（DIVI）は、血管作動性化合物が内皮血管および周囲の平滑筋を損傷し、炎症および血管病変の発生を引き起こす場合に発生します。² DIVIは予測が困難であり、多様な分類や疾患特異的カテゴリーの薬物によって誘発される可能性があります。³ DIVIに関連する薬物毒性は新規薬物候補の約2.5％に影響を与えるため、血管作動性化合物の早期同定は前臨床薬物開発において重要です。⁴

内皮細胞（EC）活性化はDIVIの重要な前駆段階です。⁵ ECは、疾患（例：敗血症、ウイルス性出血熱）、サイトカイン、外部の機械的力、または薬物治療に応じてこの炎症促進表現型を採用します。⁶ EC活性化は内皮血管の完全性を損傷・変化させ、血管透過性、血管運動緊張、バイオマーカー発現（例：E-セレクチン、P-セレクチン、ICAM1、VCAM1）の変化を引き起こします。⁷ 血管透過性は、タイトジャンクション（TJ）およびアドヘレンスジャンクション（AJ）を含む細胞間接合系によって制御されています。⁸ これらのタンパク質間相互作用は、選択的透過性バリアを形成し、細胞間輸送を支え血管の完全性を維持します。⁹ 血管作動性化合物による処理に応答して内皮細胞が活性化されると、タイトジャンクションタンパク質の組織変化により局所的な内皮ギャップが形成されることがあります。これらのギャップはバリアの完全性と細胞間接合部の孔径を変化させ、内皮透過性の調節不全や血管の「漏れ」を引き起こします。⁸

内皮細胞活性化を測定するin vitroモデルを確立するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を6 x 10⁴細胞/cm²の密度で細胞培養インサートに播種しました（図1）。EVOM™ ManualとEndOhm TEER電極を用いて数日間にわたりTEERを測定し、コンフルエンシーに達するまで観察しました。コンフルエントなHUVECは10または50 ng/mlのTNF-αで24時間処理され、TEER測定が行われました。蛍光トレーサー（4 kDa FITC-デキストラン）を頂側チャンバーに1時間添加し、底側チャンバーのトレーサー量をプレートリーダー（励起/発光495/535）で測定しました。

図2– TNF-α処理したHUVECのTEERおよび蛍光トレーサー透過性の結果。

EVOM™ ManualとEndOhm TEER電極は、24時間のTNF-α処理後にHUVECのTEERが低下することを測定し、10および50 ng/mlの両用量で低いTEER値が類似していることを示しました（図2A）。蛍光トレーサーを用いた透過性解析では、50 ng/mlのTNF-α処理細胞が10 ng/ml処理細胞よりも蛍光トレーサーに対して透過性が高いことが示されました（図2B）。FITC-デキストランのような細胞間トレーサーの透過性はタイトジャンクションの孔径および細胞間の水流に依存し、一方TEER値はイオン伝導度の影響を受けます。1 TNF-α処理HUVECはタイトジャンクションのサイズ排除能力（透過性；図2B）および細胞間輸送（TEER；図2A）に変化を示します。これらのデータは、EVOM™ ManualとEndOhm電極を透過性トレーサーアッセイと組み合わせて用いることで、サイトカインが細胞間接合部および内皮活性化状態に与える影響を評価できることを示しています。

注意：薬物誘発性治療効果が内皮バリアの完全性に与える影響を評価する受託研究サービスにご興味がある場合は、SynVivo Inc.までsupport@synvivobio.comにお問い合わせください。

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参考文献

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