Quantificazione di DNA/RNA con DIPUV-Mini e uno spettrometro Tidas
Abstract
Le concentrazioni di DNA in soluzione (31µg/mL e 688µg/mL) sono state misurate con uno spettrometro e una sorgente luminosa UV/VIS in un DIPUV-Mini. Grazie al cammino ottico di 2mm, l’uso di un DIPUV-Mini non richiede una diluizione prima della misurazione in questo intervallo di concentrazioni, eliminando così una potenziale fonte di errore.
Procedura sperimentale
Sono state preparate gravimetricamente soluzioni standard di DNA (Sigma D1626), usando come solvente acqua ultrapura da 18.2MΩ/cm. Le soluzioni sono state preparate a concentrazioni comprese tra 0.0µg/mL e 687.6µg/mL.
Le misurazioni sono state effettuate in triplicato usando un DIPUV-Mini. Il DIPUV-Mini è stato collegato a una sorgente luminosa UV/VIS (WPI #D4H).
I dati sono stati raccolti con incrementi di 1nm sull’intero intervallo dello strumento (190nm-720nm). Lo strumento è stato configurato in modo che le misurazioni di riferimento restituissero un’intensità totale dell’80%. Per tutte le misurazioni è stata utilizzata come soluzione di riferimento acqua ultrapura da 18.2MΩ/cm.
Risultati
I risultati sperimentali sono riportati nella Tabella 1:
| DNA [µg/mL] | Assorbanza @260nm [AU] |
| 0.00 | -0.0017 |
| 30.83 | 0.1116 |
| 56.59 | 0.1945 |
| 85.49 | 0.3012 |
| 115.66 | 0.3821 |
| 143.94 | 0.4551 |
| 281.63 | 0.8399 |
| 428.91 | 1.2409 |
| 561.15 | 1.5639 |
| 687.61 | 1.7340 |
Tabella 1: Concentrazioni di DNA e valori di assorbanza risultanti
Poiché l’assorbanza è correlata alla concentrazione secondo la legge di Beer-Lambert,
A= εlc
I valori di assorbanza attesi sono stati calcolati a partire dalle concentrazioni delle soluzioni di DNA. I valori di letteratura di ε per il DNA a doppio filamento sono riportati come 0.020µg/ml*cm.
I dati sperimentali sono riportati nella Figura 1, con le misurazioni di assorbanza calcolate indicate da una linea continua. Le misurazioni di assorbanza sono espresse a una lunghezza d’onda di 260nm. La deviazione dal valore teorico a valori di assorbanza più elevati è dovuta all’interferenza della luce parassita all’interno dello spettrometro.
Figura 1: Assorbanza misurata rispetto a quella teorica
Figura 2: Misurazione tipica del DNA (281.6µg/mL)
