Automatisation et optimisation

Les astrocytes humains primaires (iXCells 10HU-035) ont été décongelés dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ; 10-013-CM) supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; 35-010-CV) et maintenus sur des flacons revêtus de collagène de type I Corning® BioCoat® (354486). Une banque opérationnelle de cellules cryoconservées a été utilisée après décongélation ou après un passage unique dans un nouveau flacon revêtu de collagène. La lignée cellulaire neuroblastome SH-SY5Y (ATCC® ; CRL-2266) a été maintenue dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FBS. Les hCMEC/D3 (MilliporeSigma ; SCC066) ont été cultivées sur des flacons revêtus de collagène de type I Corning® BioCoat® dans de l’EBM-2 (Lonza ; 3156) supplémenté avec EGM-2 MV (Lonza ; 4147), ainsi qu’avec 2,5 % supplémentaires de FBS et 1 % de concentré lipidique chimiquement modifié (Thermo Scientific ; 11905031).

Diverses combinaisons de cultures simples, co- et tri-cultures ont été mises en place en utilisant des supports perméables Corning® HTS Transwell®-24 puits de 0,4 μm (3379). Pour les inserts cultivés avec des astrocytes, une goutte de 50 μL de matrice de membrane basale Corning® Matrigel® à facteur de croissance réduit à 100 μg/mL, diluée dans du tampon phosphate salin (PBS ; 21-040-CM), a été appliquée sur la face inférieure de l’insert en inversant la plaque sur son couvercle. Les inserts ont été incubés dans la hotte à flux laminaire pendant une heure avant aspiration, suivie du semis des astrocytes. Les astrocytes ont été récoltés avec la solution de détachement cellulaire Accutase® (25-058-CI) et remis en suspension dans du DMEM contenant 10 % de FBS à une densité de 264 000 cellules/mL. Une goutte de 50 μL de cellules (75 000 cellules/cm2) a été ajoutée à chaque insert inversé et les cellules ont été laissées à adhérer pendant une heure avant de remettre la plaque en position de culture standard et de remplir les inserts avec 200 μL et le puits récepteur avec 500 μL de DMEM plus 10 % de FBS. Le même jour, les plaques réceptrices (3524) incluant les cellules SH-SY5Y ont été ensemencées avec des cellules récoltées à l’Accutase à 10 000 cellules/cm2 dans 500 μL de DMEM contenant 10 % de FBS. Les cultures d’astrocytes et de SH-SY5Y ont été incubées séparément pendant environ 72 heures avant l’ajout des hCMEC/D3. Les hCMEC/D3 ont été récoltées avec Accutase et ensemencées dans les inserts avec ou sans astrocytes à une densité de 40 000 cellules/cm2 dans 300 μL de milieu d’essai hCMEC/D3. Le milieu d’essai hCMEC/D3 était composé d’EBM-2 supplémenté avec EGM (Lonza ; 4133) sans extrait de cerveau bovin, avec un supplément additionnel de 3 % de FBS et 1 % de concentré lipidique chimiquement modifié. Les inserts ont été combinés avec des plaques de culture cellulaire avec ou sans cellules SH-SY5Y en utilisant 1 mL de milieu d’essai hCMEC/D3 dans la plaque de culture cellulaire en dessous. Le milieu a été renouvelé tous les deux jours. Quarante-huit heures après l’ajout des hCMEC/D3, certaines cultures ont été exposées à des conditions de cisaillement en les plaçant sur un agitateur orbital à basse vitesse Corning® LSE™ (6780-FP) à 50 tours par minute. La TEER a été mesurée quotidiennement après l’ajout des cellules hCMEC/D3 à l’aide du World Precision Instruments EVOM™ AUTO (EVA-MT-03-02).

Des monocouches de 24 HTS ont été fixées en aspirant le milieu et en le remplaçant par 500 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (Boston BioProducts ; BM-155) par insert et 1 mL par plaque de culture cellulaire. Après 15 minutes à température ambiante, les inserts ont été lavés avec le même volume de PBS. Les monocouches ont ensuite été perméabilisées avec 0,1 % de Triton X (Integra Chemical Company ; T756.30.30) pendant 15 minutes, puis lavées à nouveau avec du PBS. Les monocouches ont ensuite été bloquées avec 2 % d’albumine sérique bovine (MilliporeSigma ; A9576) dans du PBS toute la nuit à 2-8º C. Le lendemain, les cellules ont été lavées avec du PBS et les monocouches ont été colorées avec 100 μL de ZO-1 dilué à 1:1000 (Invitrogen ; 740002MP647) toute la nuit à 2-8º C.

Après optimisation dans les supports perméables Corning® HTS Transwell® 24 puits, le même protocole a été appliqué aux supports perméables Corning® HTS Transwell® 96 puits de 0,4 μm (7369) en utilisant uniquement les conditions Astrocyte avec hCMEMC/D3 et SH-SY-5Y avec hCMEMC/D3. Le revêtement de Matrigel et les volumes de semis d’Astrocytes sur la face inférieure des inserts ont été réduits à 22 μL par insert et les concentrations ont été ajustées pour maintenir la même quantité en μg ou en cellules par cm2. Après l’adhésion des cellules Astrocytes, 100 μL de DMEM avec 10 % de FBS ont été ajoutés à chaque insert et 200 μL par puits récepteur. De plus, les cellules SH-SY-5Y ont été semées dans les plaques réceptrices Corning HTS Transwell-96 (3382) à raison de 200 μL par puits. Un cisaillement a été appliqué à tous les inserts après 48 heures d’adhésion des hCMEC/D3. La TEER a été mesurée quotidiennement à l’aide du réseau d’électrodes EVA-MT-03-01.

Environ 120 heures après l'ajout de hCMEC/D3, le milieu a été aspiré des supports perméables Corning® HTS Transwell® 96 et remplacé par des dilutions en série de lipopolysaccharide (LPS ; Invitrogen ; 00-4976-93), d'insuline (Thermo Scientific ; 12585014), de TNF alpha (Thermo Scientific ; 300-01A-500 μg) ou de milieu en tant que contrôle négatif. Les composés ont été incubés avec les cultures sur agitateur pendant 48 heures, la TEER étant mesurée quotidiennement.

Figure 1 : La contrainte de cisaillement augmente l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). A. Après cinq jours en conditions statiques, lorsque les cellules sont cultivées sur des plaques transwell en l'absence de contrainte de cisaillement induite par la gravité, les cellules hCMEC/D3 présentent des valeurs de TEER plus élevées que les astrocytes lorsque les cellules hCMEC/D3 sont cultivées seules ou en combinaison avec des astrocytes et/ou des cellules de neuroblastome (SH-SY5Y). B.

TEER est une technique analytique fonctionnelle non destructive de lecture de l'intégrité de la barrière, qui peut être utilisée pour surveiller les changements dans les modèles tissulaires 2D et 3D et corréler les phénomènes in vitro et in vivo.

Figure 2 : L'immunohistochimie ZO-1 montre une augmentation des jonctions serrées et de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) des cellules hCMEC/D3 sous contrainte de cisaillement. Images représentatives de diverses combinaisons cellulaires sur supports perméables cultivées en conditions statiques (rangée du haut) ou sous cisaillement (rangée du bas). Cultures fixées au jour 8. Images prises avec un confocal à balayage laser Leica Stellaris 5 avec un objectif à immersion dans l'huile 40x/1,3 NA. L’échelle est de 20 μm.

Figure 3 : Les modèles BBB cultivés dans des plaques HTS 96 puits montrent une augmentation de l'intégrité de la barrière et une diminution de la perméabilité mesurées par TEER sur 5 jours. Moyenne des mesures TEER issues de trois réplicats techniques par expérience et de trois expériences indépendantes après soustraction du fond des transwells sans cellules (milieu seul). Données présentées avec l'erreur standard. L'analyse statistique a trouvé p<0,05 comme indiqué par * utilisant un test t bilatéral non apparié. Figure 4 : Le LPS augmente la perméabilité de la BBB. Impact du LPS. Moyenne des mesures TEER des cultures exposées à des concentrations croissantes de LPS pendant 48 heures. Les données sont la moyenne de trois réplicats techniques par expérience et de trois expériences indépendantes, présentées avec l'erreur standard. ANOVA avec test post hoc de Dunnett en comparaison au milieu seul. *=p<0,05, **=p<0,005, ***=p<0,001, ****=p<0,0001. Impact de l'insuline. Moyenne des mesures TEER des cultures exposées à des concentrations croissantes d'insuline pendant 48 heures. Les données sont la moyenne de trois réplicats techniques par expérience et de trois expériences, présentées avec l'erreur standard. ANOVA avec test post hoc de Dunnett en comparaison au milieu seul. *=p<0,05, **=p<0,005, ***=p<0,001, ****=p<0,0001. Impact du TNF-α. Moyenne des mesures TEER des cultures exposées à des concentrations croissantes de TNF-α pendant 48 heures. Les données sont la moyenne de trois réplicats techniques par expérience et de trois expériences, présentées avec l'erreur standard. ANOVA avec test post hoc de Dunnett en comparaison au milieu seul. *=p<0,05, **=p<0,005, ***=p<0,001, ****=p<0,0001.

L'ajout de cisaillement via un agitateur orbital à basse vitesse et/ou des types cellulaires BBB supplémentaires pertinents tels que les astrocytes primaires ou SH-SY5Y peut augmenter statistiquement les mesures TEER par rapport aux barrières hCMEC/D3 en culture statique.

La coloration en immunocytochimie montre une alignement plus linéaire des cellules hCMEC/D3 cultivées sous des conditions de cisaillement.

Le EVOM™ Auto automatise rapidement et de manière reproductible les mesures de TEER dans des monocouches endothéliales cultivées sur des supports perméables Corning Transwell à 24 puits et 96 puits. La capacité de surveiller l’intégrité de la barrière de façon aseptique et non destructive permet aux chercheurs d’utiliser efficacement le TEER comme mesure en temps réel de la perméabilité pour des études longitudinales à long terme, avec une réduction des coûts et de la variabilité.

La combinaison de l'EVOM Auto et des supports perméables Corning Transwell permet une optimisation facile des modèles de barrière et des tests à plus haut débit.