Mesures TEER automatisées

Les cellules épithéliales de l'intestin grêle (SMI) ont été prélevées sur des donneurs post-mortem après approbation du comité d'éthique (IRB). Les cellules SMI ont été ensemencées sur des plaques de culture cellulaire PermaCell™ à haute densité de pores (0,4 µm, 1,0x10^8 pores/cm²) en membrane PET 96 puits (MatTek Life Sciences ; Ashland, MA), élevées à l'interface air-liquide (ALI) et cultivées dans un milieu de culture spécialement formulé pour induire la différenciation pendant 2 semaines. Une image du système PermaCell™ 96 puits et une coupe représentative colorée H&E du modèle tissulaire EpiIntestinal™ sont présentées dans la Fig. 1A-D.

Fig. 1 – Mesure de la TEER sur tissu EpiIntestinal cultivé dans une plaque PermaCell 96 puits à haut débit. A) Couvercle de la plaque. B) Plaque insert avec membrane de 0,4 µm au fond. C) Plaque réservoir. D) Coupe colorée H&E du tissu EpiIntestinal™ cultivé dans la plaque insert 96 puits. E) Coupe des plaques insert et fond remplies de 100 mM KCl montrant les électrodes TEER.

Avant les mesures de TEER, les tissus EpiIntestinal™ ont été transférés dans une solution stérile de KCl 100 mM (150 µL en apical, 400 µL en basolatéral). La TEER a été mesurée manuellement à l’aide d’une électrode STX HTS EVOM™ en conjonction avec un EVOM™ Manuel, ainsi qu’automatiquement avec le système automatisé de mesure TEER EVOM™ Auto (World Precision Instruments, LLC, Sarasota, Floride). Un schéma du système Permacell™ 96 puits montrant l’emplacement des électrodes EVOM™ Auto 96 HTS est présenté à la Fig. 1E. Une comparaison entre l’EVOM™ Manuel avec l’électrode STX HTS EVOM™ et les systèmes EVOM™ Auto est montrée à la Fig. 2A-B. Les lectures automatisées ont été effectuées avec un temps de lecture de 2 secondes par puits. Avant le calcul de la TEER, les mesures de résistance des échantillons tissulaires ont été corrigées en soustrayant la résistance de fond correspondant aux valeurs de la solution tampon KCl 100 mM vide dans la plaque réceptrice de l’assemblage 96-transwell.

Fig. 2–L’EVOM™ Auto permet des mesures TEER à haut débit. A) L’EVOM™ Manuel avec électrode STX HTS dans une plaque Transwell 96 puits prend 24 minutes et 3 secondes pour mesurer 96 échantillons. B) Le système EVOM™ Auto pour la mesure automatisée de la TEER dans une plaque 96 puits nécessite seulement 4 minutes et 10 secondes pour lire 96 échantillons.

Avant l'exposition aux articles testés, des mesures de référence de la fonction de barrière tissulaire (TEER) ont été prises selon les méthodes décrites ci-dessus. Une exposition à court terme (trois heures) à l'acide éthylène glycol tétra-acétique (EGTA) a été réalisée en utilisant une solution tamponnée saline de Hank 1X (HBSS) contenant 10 mM de HEPES comme véhicule appliqué à la surface apicale. Une exposition à long terme (6 jours) au sulfate de dextrane sel de sodium (DSS) a été effectuée en ajoutant le DSS au milieu de culture dans les compartiments apical et basolatéral. Les dommages tissulaires réversibles évalués par TEER sont exprimés par rapport aux tissus témoins respectifs traités avec le véhicule.

Les échantillons de tissu ont été fixés pendant 3 heures dans du formol à 10 %, perméabilisés pendant 30 minutes avec une solution tamponnée au Tris 1X (TBS) contenant 0,1 % de Triton-X-100, puis bloqués pendant 2 heures dans du TBS 1X contenant 10 % de sérum de chèvre normal. L’anticorps monoclonal recombinant de lapin anti-Claudin 1 (Abcam réf. ab211737, Cambridge, MA) a été dilué à 1:1 000 dans le TBS et incubé à température ambiante pendant 2 heures avec agitation douce. L’anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de lapin (H+L), Alexa Fluor™ 555 (ThermoFisher réf. A21429, Waltham, MA) a été dilué à 1:400 dans le TBS et incubé à température ambiante pendant 1 heure avec agitation douce. Les noyaux ont été contre-colorés avec du 4’,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal Olympus FV1000 avec un objectif 2X et un objectif à immersion huile 40X. Des images représentatives de la coloration IHC sont présentées en Fig. 3D et Fig. 4D pour les expositions à l’EGTA et au DSS, respectivement.

Fig. 3 – Le modèle tissulaire EpiIntestinal™ montre une récupération complète après une exposition de 30 heures à l’EGTA et une incubation post-exposition de 48 heures. A) Mesures TEER. B) Perméabilité au Lucifer Yellow (LY). C) Coefficient de perméabilité apparente pour le LY. Équation de calcul : , où ΔQ/Δt est la concentration de LY présente dans le compartiment basolatéral après le temps écoulé, Vr est le volume du tampon récepteur dans le compartiment basolatéral, A est la surface du tissu et C est la concentration initiale de LY appliquée à la surface apicale du tissu. D) Immunomarquage de la protéine de barrière, Claudin 1 (rouge), contre-coloré au DAPI (cyan). Barres d’erreur = écart type. Fig. 4 – Effets sur le modèle tissulaire EpiIntestinal après une exposition de 6 jours au sulfate de dextrane sodium (DSS) et une incubation post-exposition de 6 jours. A) Mesures TEER. B) Perméabilité au Lucifer Yellow (LY). C) Coefficient de perméabilité apparente pour le LY. Équation de calcul : P app= ∆Q/∆t x Vr/(A*C), où ∆Q/∆t est la concentration de LY présente dans le compartiment basolatéral après le temps écoulé, Vr est le volume du tampon récepteur dans le compartiment basolatéral, A est la surface du tissu et C est la concentration initiale de LY appliquée à la surface apicale du tissu. D) Immunomarquage de la protéine de barrière, Claudin 1 (rouge), contre-coloré au DAPI (cyan). Barres d’erreur = écart type.

Les tissus ont été transférés dans 250 µL de HBSS 1X contenant 10 mM de HEPES et 1,98 g/L de glucose, et 50 µL de colorant LY à 100 µM dans le même tampon ont été appliqués sur la surface apicale. La solution réceptrice (RS) basolatérale a été remplacée toutes les 30 minutes pendant 2 heures. 100 µL de chaque échantillon de RS ont été utilisés pour déterminer la concentration de LY dans la RS à chaque point temporel. Les échantillons de RS ont été lus à l’aide d’un lecteur de plaques Spectramax M2 (Molecular Devices, San Jose, CA) avec une bande d’excitation de 445-455 nm, une bande d’émission de 518-538 nm, et un réglage de sensibilité de 145.

Fig. 5 – Les mesures TEER des tissus EpiIntestinal™ cultivés dans une plaque PermaCell 96 puits sont plus cohérentes en utilisant les systèmes de mesure EVOM™ Auto par rapport à EVOM™ Manual et peuvent être collectées plus rapidement pour une facilité d’utilisation. A) Les lectures EVOM™ Auto étaient plus reproductibles et le temps pour mesurer la plaque a été considérablement réduit par rapport à EVOM™ Manual. B) Les valeurs TEER obtenues avec EVOM™ Manual étaient moins stables pendant la période de mesure que celles avec EVOM™ Auto, qui augmentaient modérément durant les mesures manuelles (p