FAQ sur la mesure TEER

Voici quelques questions fréquemment posées (FAQ) sur la mesure TEER à l’aide d’un EVOM2.

Par Subhra Nag, PhD

La résistance électrique et la résistance électrique transepitheliale (TEER) sont-elles la même chose ?

Non. Nous obtenons la valeur TEER en multipliant la valeur brute/obtenue de résistance sur un voltmètre épithélial (comme l’EVOM2) par la surface de croissance cellulaire (par exemple, la surface d’un monocouche cellulaire cultivé sur un insert de culture cellulaire).

Par exemple, si vous cultivez des cellules sur un insert de culture cellulaire d’une surface de 0,5 cm².

La lecture de résistance sur un voltmètre épithélial (ex. EVOM2) indique une valeur de 300 Ω.

TEER = 300 Ω × 0,5 cm² = 150 Ω·cm²

Qu’est-ce qu’un EndOhm ?

L’EndOhm est une chambre conçue pour l’EVOM2 dans laquelle vous placez un puits amovible pour effectuer les mesures de résistance. Cette chambre possède des électrodes en positions fixes, et la position ainsi que la stabilité des électrodes ont un impact majeur lors de la mesure de la résistance tissulaire.

Comment utilise-t-on un EVOM2 pour mesurer la confluence ?

L’EVOM2 fonctionne sur le principe que lorsque vous mesurez ce que nous appelons le puits « blanc », cette première mesure de résistance contient la somme de la résistance des électrodes, de l’écart entre les électrodes et de la résistance due au volume et à la molarité du milieu liquide. (Toute différence de charge des électrodes est annulée par la méthode de mesure de l’EVOM2 qui inverse la polarité et fait la moyenne des résultats.) Les mesures périodiques successives du puits tracent la croissance de la membrane par une mesure de résistance, et une fois que ce graphique de résistance s’est stabilisé, on peut dire que la membrane a atteint la confluence. Le système EVOM2 fonctionne comme un amplificateur à clampage de tension et un système Ussing, mais sans la chambre Ussing spéciale. Le système EVOM2 n’est pas aussi précis qu’un Ussing, mais son but est de déterminer si une membrane est confluente, et non de réaliser une analyse détaillée. (Certaines analyses de perméabilité membranaire peuvent être étudiées avec le système EVOM2, mais en pourcentage de changement plutôt qu’en valeur absolue.)

Pourquoi utiliser un EndOhm plutôt qu’un STX ?

L’EVOM2 détectera avant tout les trous d’épingle et les vides dans la membrane, car le flux électrique cherchera le point de résistance le plus faible. Les électrodes polyvalentes STX2 peuvent fléchir et modifier l’espacement des électrodes, et le fait de ne pas les maintenir immobiles dans un puits peut entraîner une erreur de résistance significative. En revanche, les électrodes EndOhm sont fixes en position. Lorsqu’elles sont correctement entretenues et prétraitées dans le milieu, elles fournissent les lectures de résistance les plus stables, répétables et fiables. L’ajout d’électrodes concentriques centrées garantit également que toute la surface de la membrane est exposée au flux de courant électrique, évitant ainsi les zones d’ombre dues à un placement en bordure, comme cela peut arriver avec les STX2. (Il convient de noter que la valeur TEER de base attendue du tissu, si elle est faible, peut compliquer les mesures sur des membranes de grande surface. Par exemple : si la valeur TEER est de 200 Ω·cm², alors un puits de 12 mm aura une valeur 1,13 fois plus faible pour la même confluence (176,9 Ω). Le même tissu à 200 Ω dans un puits de 24 mm de diamètre aura une valeur 4,52 fois plus faible, soit 44,2 Ω. Lorsque cette valeur de résistance descend en dessous d’environ 100 Ω, on observe plus d’instabilité des électrodes et les lectures peuvent varier. Nous avons constaté que le « nettoyage » et le préconditionnement des électrodes sont essentiels pour des lectures stables.)

Comment nettoyer mes électrodes ?

Le nettoyage des électrodes consiste en l’utilisation périodique d’un nettoyant enzymatique (Enzol, Tergazyme) et/ou un trempage dans de l’eau de Javel domestique non parfumée (3 % NaClO). L’eau de Javel sert à reconstituer la surface d’Ag en AgCl et à dissoudre les protéines accumulées. Ces deux effets conduisent à une instabilité des électrodes. Le nettoyant enzymatique est un agent sûr pour éliminer les résidus déposés sur les électrodes par les composants du milieu comme le DMEM. Si ces résidus s’accumulent, la lecture de résistance augmente et peut devenir instable.

Qu’en est-il du préconditionnement des électrodes ?

Le préconditionnement des électrodes consiste à les faire tremper dans le milieu de mesure pendant un certain temps afin de permettre à tout liquide étranger de migrer hors des pellets perméables. L’alcool est couramment utilisé pour stériliser ces électrodes, mais il s’imprègne dans celles-ci et agit comme une résistance élevée au passage du courant électrique. Au fur et à mesure que l’alcool est remplacé lentement par un milieu salin à l’intérieur de l’électrode, la lecture de résistance diminue progressivement.

Pouvez-vous me proposer un système simple d’acquisition de données pour la TEER ?

Le Lab-Trax-4 est un enregistreur de données analogique-numérique silencieux, 12 bits, à quatre canaux, avec des vitesses d’échantillonnage allant jusqu’à 10 000 échantillons par seconde ou 2500 s/S pour les quatre canaux. Cet appareil est alimenté directement par le port USB2 et peut être utilisé sur un ordinateur portable sur le terrain comme unité portable. Le matériel dispose de quatre entrées numériques et quatre sorties numériques, si nécessaire.

Le logiciel LabScribe3 est facile à utiliser et fréquemment mis à jour pour répondre aux exigences les plus récentes. À mesure que Microsoft met à jour ses systèmes d’exploitation, le matériel continuera d’être pris en charge par les nouvelles versions de LabScribe. Il est également désormais compatible avec les ordinateurs Mac et Linux. Si vous utilisez un STX2 pour effectuer ces mesures, vous pourriez avoir besoin d’une paire de mains supplémentaire pour saisir du texte. Si vous saisissez votre texte dans le champ Marks avant de faire les mesures, il vous suffira d’appuyer sur la touche Entrée pour placer la marque lorsque votre lecture TEER s’est stabilisée. Si vous utilisez un STX100, vous aurez les mains libres pour faire des annotations.

Quels sont les défis liés à la mesure TEER que je pourrais rencontrer ?

Ce point a été écrit pour traiter des problèmes avec le STX2, mais il s’applique aussi à l’EndOhm.

Chacun des éléments suivants peut modifier la lecture de résistance :

• Écart entre les électrodes. Ne pas écarter ni comprimer l’écart des électrodes STX2.
• Résistance des électrodes. Gardez les électrodes propres et conditionnées.
• Profondeur des électrodes. Plongez toujours les électrodes d’au moins 2 mm.
• Électrodes proches des parois en plastique. Essayez de maintenir les électrodes éloignées des parois de la plaque, si possible.
• Placement des électrodes. Si vous posez habituellement la patte la plus longue de l’électrode sur le fond de la plaque, répétez ce placement pour plus de cohérence.
• Résistance du liquide. Ne laissez pas le milieu s’évaporer et ne le diluez pas.
• Niveaux de liquide. Essayez de maintenir le même volume de liquide pour chaque lecture. Une petite variation peut avoir un grand effet dans un petit insert.
• Mouvements excessifs. Essayez de maintenir les électrodes immobiles. Dans certains cas, un support mécanique pour électrodes peut être utilisé.
• Le lavage ou le changement de milieu peut provoquer une rupture dans la membrane de l’insert de culture cellulaire. Le changement de liquide doit être effectué avec précaution le long de la paroi des inserts. Un petit espace où le tissu ou la couche cellulaire se soulève de la membrane de l’insert peut ouvrir un chemin clair pour que l’EVOM2 lise une résistance plus faible. Le courant fuit par cet espace plutôt que de passer à travers la membrane contenant le monocouche cellulaire, car l’électricité suit le chemin de moindre résistance. Dans ce cas, vous remarquerez une chute drastique de la résistance. Lorsque vous observez une telle baisse importante de la valeur de résistance, nous vous recommandons de vérifier votre échantillon (par exemple, monocouche cellulaire sur un insert de culture) au microscope pour voir s’il y a une rupture dans le filtre ou une grande zone vide indiquant qu’un groupe de cellules s’est détaché.

Prendre plusieurs lectures dans le même puits (3 à 5 fois) et calculer la moyenne peut réduire la variabilité.

Pouvez-vous suggérer quelques paramètres expérimentaux à contrôler pour obtenir des résultats TEER cohérents ?

• La température influence les valeurs TEER. Nous recommandons de maintenir une température constante pour obtenir des valeurs cohérentes. Comme les lectures sont effectuées dans un milieu de culture ou tampon, nous recommandons d’utiliser un bain-marie à température fixe pour chauffer le milieu/tampon utilisé pendant l’expérience. Une température constante du milieu/tampon garantit des conditions expérimentales stables. Nous recommandons de sortir la plaque de puits, contenant les cellules cultivées sur les inserts, de l’incubateur au moins 20 minutes avant les mesures pour stabiliser la plaque à température ambiante.
• Si vous utilisez une chambre EndOhm, assurez-vous de maintenir la même distance fixe entre les électrodes supérieure et inférieure pour obtenir des lectures cohérentes. Si vous utilisez une électrode en forme de baguettes (STX2), essayez de la tenir en position verticale pendant les mesures. La cohérence dans le maintien de la même position des électrodes baguettes pendant l’expérience devrait garantir des lectures constantes.
• Nous recommandons d’utiliser le même liquide avec la même concentration ionique à la fois du côté apical (par exemple, dessus d’un insert de culture cellulaire) et du côté basolatéral (par exemple, dessous de l’insert dans un puits d’une plaque à 12 puits). Pendant la mesure, si vous utilisez un tampon PBS 1X du côté apical, nous recommandons d’utiliser également un tampon PBS 1X du côté basolatéral. Nous recommandons aussi que les niveaux de liquide (à l’intérieur et à l’extérieur des inserts) soient au même niveau pour minimiser les différences de pression. Pendant les expériences, le puits/ côté apical est rempli en premier pour éviter que la membrane ne se décolle du filtre sous l’effet des pressions hydrostatiques.
• L’application de volumes constants de liquide (milieu/tampon) lors de toutes les expériences réduira la variabilité des données.

Pour plus d’informations, voir Enregistrement des mesures TEER avec un EVOM2.

NOTE : L’EVOM2 a été remplacé par l’EVOM™ Manuel, et le système Ussing a été abandonné.