Automatización y Optimización

Los astrocitos humanos primarios (iXCells 10HU-035) se descongelaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; 10-013-CM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; 35-010-CV) y se mantuvieron en matraces recubiertos con colágeno I Corning® BioCoat® (354486). Se utilizó un banco de trabajo de células criopreservadas tras su recuperación del descongelamiento o después de un solo pase a un nuevo matraz recubierto de colágeno. La línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y (ATCC®; CRL-2266) se mantuvo en DMEM suplementado con 10% de FBS. hCMEC/D3 (MilliporeSigma; SCC066) se cultivó en matraces recubiertos con colágeno I Corning® BioCoat® en EBM-2 (Lonza; 3156) suplementado con EGM-2 MV (Lonza; 4147), además de 2.5% de FBS y 1% de concentrado lipídico modificado químicamente (Thermo Scientific; 11905031).

Se establecieron varias combinaciones de cultivos simples, co-cultivos y tri-cultivos utilizando soportes permeables Corning® HTS Transwell® de 24 pocillos y 0.4 μm (3379). Para los insertos cultivados con astrocitos, se aplicó una gota de 50 μL de 100 μg/mL de la matriz de membrana basal Corning® Matrigel® con factor de crecimiento reducido, diluida en solución salina tamponada con fosfato (PBS; 21-040-CM), en la parte inferior del inserto invirtiendo la placa sobre su tapa. Los insertos se incubaron en la campana de flujo laminar durante una hora antes de aspirar y luego sembrar los astrocitos. Los astrocitos se recolectaron con la solución de desprendimiento celular Accutase® (25-058-CI) y se resuspendieron en DMEM con 10% de suero fetal bovino (FBS) a una densidad de 264,000 células/mL. Se añadió una gota de 50 μL de células (75,000 células/cm2) a cada inserto invertido y se permitió que las células se adhirieran durante una hora antes de volver a colocar la placa en posición estándar de cultivo y llenar los insertos con 200 μL y el pocillo receptor con 500 μL de DMEM más 10% de FBS. Ese mismo día, las placas receptoras (3524) que incluyen SH-SY5Y se sembraron con células recolectadas con Accutase a 10,000 células/cm2 en 500 μL de DMEM con 10% de FBS. Los cultivos de astrocitos y SH-SY5Y se incubaron por separado durante aproximadamente 72 horas antes de la adición de hCMEC/D3. Las células hCMEC/D3 se recolectaron con Accutase y se sembraron en los insertos con o sin astrocitos a una densidad de 40,000 células/cm2 en 300 μL del medio de ensayo hCMEC/D3. El medio de ensayo hCMEC/D3 consistió en EBM-2 suplementado con EGM (Lonza; 4133) sin extracto cerebral bovino, un 3% adicional de FBS y 1% de concentrado de lípidos químicamente modificado. Los insertos se combinaron con placas de cultivo celular con o sin células SH-SY5Y usando 1 mL de medio de ensayo hCMEC/D3 en la placa de cultivo celular inferior. El medio se cambió cada dos días. Cuarenta y ocho horas después de la adición de hCMEC/D3, algunos cultivos se expusieron a condiciones de cizallamiento colocándolos en un agitador orbital de baja velocidad Corning® LSE™ (6780-FP) a 50 RPM. La resistencia eléctrica transendotelial (TEER) se midió diariamente después de la adición de las células hCMEC/D3 usando el EVOM™ AUTO de World Precision Instruments (EVA-MT-03-02).

Las monocapas de 24 HTS se fijaron aspirando el medio y reemplazándolo con 500 μL de paraformaldehído al 4% (PFA; Boston BioProducts; BM-155) por inserto y 1 mL por placa de cultivo celular. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, los insertos se lavaron con el mismo volumen de PBS. Luego, las monocapas se permeabilizaron con 0.1% Triton X (Integra Chemical Company; T756.30.30) durante 15 minutos y se lavaron nuevamente con PBS. Posteriormente, las monocapas se bloquearon con 2% de albúmina sérica bovina (MilliporeSigma; A9576) en PBS durante toda la noche a 2-8º C. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y las monocapas se tiñeron con 100 μL de ZO-1 diluido 1:1000 (Invitrogen; 740002MP647) durante toda la noche a 2-8º C.

Después de la optimización en los Soportes Permeables Corning® HTS Transwell® de 24 pocillos, se aplicó el mismo protocolo a los Soportes Permeables Corning® HTS Transwell® de 96 pocillos y 0.4 μm (7369) utilizando solo las condiciones de Astrocitos con hCMEMC/D3 y SH-SY-5Y con hCMEMC/D3. El recubrimiento de Matrigel y los volúmenes de siembra de astrocitos en la parte inferior de los insertos se redujeron a 22 μL por inserto y las concentraciones se ajustaron para mantener la misma cantidad de μg o células por cm2. Después de la adhesión de las células de astrocitos, se añadieron 100 μL de DMEM con 10% de FBS a cada inserto y 200 μL por pocillo receptor. Además, las células SH-SY-5Y se sembraron en las Placas Receptoras Corning HTS Transwell-96 (3382) con 200 μL por pocillo. Se aplicó cizallamiento a todos los insertos después de 48 horas de adhesión de hCMEC/D3. La TEER se midió diariamente usando el arreglo de electrodos EVA-MT-03-01.

Aproximadamente, 120 horas después de la adición de hCMEC/D3, se aspiró el medio de los soportes permeables Corning® HTS Transwell® 96 y se reemplazó con Lipopolisacárido (LPS; Invitrogen; 00-4976-93), Insulina (Thermo Scientific; 12585014), TNF alfa (Thermo Scientific; 300-01A-500 μg) o medio como control negativo, todos ellos diluidos en serie. Los compuestos se incubaron con los cultivos en agitador durante 48 horas, midiendo la TEER diariamente.

Figura 1: El esfuerzo cortante aumenta la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB). A. Después de cinco días en condiciones estáticas, cuando las células se cultivan en placas transwell en ausencia de esfuerzo cortante impulsado por la gravedad, las células hCMEC/D3 muestran valores de TEER más altos que los astrocitos cuando las células hCMEC/D3 se cultivan solas o en combinación con astrocitos y/o células de neuroblastoma (SH-SY5Y). B.

TEER es una técnica analítica funcional no destructiva para evaluar la integridad de la barrera, que se puede usar para monitorear cambios en modelos tisulares 2D y 3D y correlacionar fenómenos in vitro e in vivo.

Figura 2: La inmunohistoquímica de ZO-1 muestra un aumento de las uniones estrechas y la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) en células hCMEC/D3 bajo esfuerzo cortante. Imágenes representativas de varias combinaciones celulares en soportes permeables cultivados en condiciones estáticas (fila superior) o de esfuerzo cortante (fila inferior). Cultivos fijados en el día 8. Imágenes tomadas con un microscopio confocal de escaneo láser Leica Stellaris 5 con un objetivo de inmersión en aceite 40x/1.3 NA. La escala es de 20 μm.

Figura 3: Los modelos BBB cultivados en placas HTS de 96 pocillos muestran un aumento en la integridad de la barrera y una disminución en la permeabilidad medida por TEER durante 5 días. Mediciones promedio de TEER de tres réplicas técnicas por experimento y tres experimentos independientes después de la sustracción del fondo de transwells sin células (solo medio). Datos mostrados con error estándar. El análisis estadístico encontró p<0.05 como se indica con * usando una prueba t de dos colas no apareada. Figura 4: LPS aumenta la permeabilidad de la BBB. Impacto del LPS. Medición promedio de TEER de cultivos expuestos a concentraciones crecientes de LPS durante 48 horas. Los datos son el promedio de tres réplicas técnicas por experimento y tres experimentos independientes, mostrados con error estándar. ANOVA con prueba post hoc de Dunnett en comparación con solo medio. *=p<0.05, **=p<0.005, ***=p<0.001, ****=p<0.0001. Impacto de la insulina. Medición promedio de TEER de cultivos expuestos a concentraciones crecientes de insulina durante 48 horas. Los datos son el promedio de tres réplicas técnicas por experimento y tres experimentos, mostrados con error estándar. ANOVA con prueba post hoc de Dunnett en comparación con solo medio. *=p<0.05, **=p<0.005, ***=p<0.001, ****=p<0.0001. Impacto del TNF-α. Medición promedio de TEER de cultivos expuestos a concentraciones crecientes de TNF-α durante 48 horas. Los datos son el promedio de tres réplicas técnicas por experimento y tres experimentos, mostrados con error estándar. ANOVA con prueba post hoc de Dunnett en comparación con solo medio. *=p<0.05, **=p<0.005, ***=p<0.001, ****=p<0.0001.

Agregar cizalladura mediante un agitador orbital de baja velocidad y/o tipos celulares adicionales relevantes para BBB, como astrocitos primarios o SH-SY5Y, puede aumentar estadísticamente las lecturas de TEER en comparación con las barreras hCMEC/D3 en cultivo estático.

La tinción de inmunocitoquímica muestra la aparición de una alineación más lineal de las células hCMEC/D3 cultivadas bajo condiciones de cizallamiento.

El EVOM™ Auto automatiza rápida y reproduciblemente las mediciones de TEER en monocapas endoteliales cultivadas en soportes permeables Corning Transwell de 24 y 96 pocillos. La capacidad de monitorear la integridad de la barrera de forma aséptica y no destructiva permite a los investigadores implementar eficientemente el TEER como una medición en tiempo real de la permeabilidad para estudios longitudinales a largo plazo, con costos y variabilidad reducidos.

La combinación del EVOM Auto y los soportes permeables Corning Transwell permite una fácil optimización del modelo de barrera y ensayos de mayor rendimiento.