Mediciones TEER automatizadas

Las células epiteliales del intestino delgado (SMI) se obtuvieron de donantes post mortem tras la aprobación del IRB. Las células SMI se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos con membrana de PET PermaCell™ de alta densidad de poros (0.4 µm, 1.0x10^8 poros/cm2) (MatTek Life Sciences; Ashland, MA), se elevaron a la interfaz aire-líquido (ALI) y se cultivaron en un medio de cultivo especialmente formulado para inducir la diferenciación durante 2 semanas. En la Fig. 1A-D se muestra una imagen del sistema PermaCell™ de 96 pocillos y una sección transversal representativa teñida con H&E del modelo tisular EpiIntestinal™.

Fig. 1–Medición de TEER en tejido EpiIntestinal cultivado en placa PermaCell de alto rendimiento de 96 pocillos. A) Tapa de la placa. B) Placa insert con membrana de 0.4 µm en la parte inferior. C) Placa reservorio. D) Sección transversal teñida con H&E del tejido EpiIntestinal™ cultivado en la placa insert de 96 pocillos. E) Sección transversal de las placas insert y base llenas con 100 mM de KCl mostrando los electrodos TEER.

Antes de las mediciones de TEER, los tejidos EpiIntestinal™ se transfirieron a KCl estéril 100 mM (150 µL apical, 400 µL basolateral). El TEER se midió tanto manualmente usando un electrodo STX HTS EVOM™ junto con un EVOM™ Manual, como automáticamente usando el sistema automatizado de medición TEER EVOM™ Auto (World Precision Instruments, LLC, Sarasota, Florida). Un esquema del sistema Permacell™ de 96 pocillos que muestra la ubicación de los electrodos EVOM™ Auto 96 HTS se muestra en la Fig. 1E. Una comparación entre el EVOM™ Manual con el electrodo STX HTS EVOM™ y los sistemas EVOM™ Auto se muestra en la Fig. 2A-B. Las lecturas automatizadas se realizaron con un tiempo de lectura de 2 segundos por pocillo. Antes del cálculo del TEER, las mediciones de resistencia de las muestras de tejido se corrigieron restando el valor de fondo usando los valores de resistencia del tampón KCl 100 mM en blanco en la placa receptora del conjunto de 96 transwell.

Fig. 2–El EVOM™ Auto permite mediciones de TEER de alto rendimiento. A) El EVOM™ Manual con electrodo STX HTS en una placa Transwell de 96 pocillos tarda 24 minutos y 3 segundos en medir 96 muestras. B) El sistema EVOM™ Auto para la medición automatizada de TEER en placa de 96 pocillos requiere solo 4 minutos y 10 segundos para leer 96 muestras.

Antes de la exposición a los artículos de prueba, se tomaron mediciones iniciales de la función de la barrera tisular (TEER) según los métodos indicados anteriormente. La exposición a corto plazo (tres horas) a ácido etilén-diamino tetra-acético (EGTA) se realizó utilizando solución salina tamponada con Hank 1X (HBSS) que contenía 10 mM de HEPES como vehículo aplicado en la superficie apical. La exposición a largo plazo (6 días) a sulfato de dextrano sodio (DSS) se llevó a cabo añadiendo DSS al medio de cultivo en ambos compartimentos, apical y basolateral. El daño tisular reversible evaluado por TEER se expresa en relación con los tejidos control tratados con el vehículo respectivo.

Las muestras de tejido se fijaron durante 3 horas en formalina al 10%, se permeabilizaron durante 30 minutos con solución salina tamponada con Tris 1X (TBS) que contenía 0.1% Triton-X-100 y se bloquearon durante 2 horas en TBS 1X que contenía 10% de suero normal de cabra. El anticuerpo monoclonal recombinante de conejo anti-Claudina 1 (Abcam cat# ab211737, Cambridge, MA) se diluyó 1:1,000 en TBS y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave. El anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo (H+L), Alexa Fluor™ 555 (ThermoFisher cat# A21429, Waltham, MA) se diluyó 1:400 en TBS y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. Los núcleos se contratiñeron con 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Las imágenes se adquirieron usando un microscopio confocal Olympus FV1000 con objetivos de 2X y de inmersión en aceite 40X. Las imágenes representativas de la tinción IHC se muestran en la Fig. 3D y Fig. 4D para las exposiciones a EGTA y DSS, respectivamente.

Fig. 3–El modelo de tejido EpiIntestinal™ demuestra recuperación completa tras 30 horas de exposición a EGTA y 48 horas de incubación post-exposición. A) Mediciones de TEER. B) Permeabilidad a Lucifer Yellow (LY). C) Coeficiente de permeabilidad aparente para LY. Ecuación para el cálculo:, donde ΔQ/Δt es la concentración de LY presente en el compartimento basolateral tras el tiempo transcurrido, Vr es el volumen del tampón receptor en el compartimento basolateral, A es el área superficial del tejido y C es la concentración inicial de LY aplicada en la superficie apical del tejido. D) Inmunotinción para la proteína de barrera, Claudina 1 (rojo), contratiñida con DAPI (cian). Barras de error = desviación estándar.Fig. 4 – Efectos en el modelo de tejido EpiIntestinal tras 6 días de exposición a sulfato de dextrano sódico (DSS) y 6 días de incubación post-exposición. A) Mediciones de TEER. B) Permeabilidad a Lucifer Yellow (LY). C) Coeficiente de permeabilidad aparente para LY. Ecuación para el cálculo: P app= ∆Q/∆t x Vr/(A*C) , donde ∆Q/∆t es la concentración de LY presente en el compartimento basolateral tras el tiempo transcurrido, Vr es el volumen del tampón receptor en el compartimento basolateral, A es el área superficial del tejido y C es la concentración inicial de LY aplicada en la superficie apical del tejido. D) Inmunotinción para la proteína de barrera, Claudina 1 (rojo), contratiñida con DAPI (cian). Barras de error = desviación estándar.

Los tejidos se transfirieron a 250 µL de HBSS 1X que contenía 10 mM de HEPES y 1,98 g/L de glucosa, y se aplicaron 50 µL de tinte LY 100 µM en el mismo tampón sobre la superficie apical. La solución receptora (RS) basolateral se reemplazó cada 30 minutos durante 2 horas. Se usaron 100 µL de cada muestra de RS para determinar la concentración de LY en la RS en cada punto temporal. Las muestras de RS se leyeron usando un lector de placas Spectramax M2 (Molecular Devices, San José, CA) con un ancho de banda de excitación de 445-455 nm, un ancho de banda de emisión de 518-538 nm y una configuración de sensibilidad de 145.

Fig. 5–Las mediciones TEER de tejidos EpiIntestinal™ cultivados en placas PermaCell de 96 pocillos son más consistentes usando los sistemas de medición EVOM™ Auto frente a EVOM™ Manual y se pueden recopilar más rápidamente para facilitar su uso. A) Las lecturas de EVOM™ Auto fueron más reproducibles y el tiempo para medir la placa se redujo drásticamente en comparación con EVOM™ Manual. B) Los valores TEER del EVOM™ Manual fueron menos estables durante el período de medición que los de EVOM™ Auto, que aumentaron moderadamente durante las mediciones manuales (p