Medidor manual EVOM™ para medición TEER con registro automático de datos

La función en blanco se utiliza cuando desea restar cualquier medición que no provenga de la membrana, como las resistencias del electrodo y del fluido.

No, la medición TEER requiere un cálculo de área. Para calcular TEER, multiplique la resistencia medida por el área de superficie correspondiente (a continuación). Por ejemplo, un inserto de 12 mm mide 565 Ω, el TEER es 565 Ω × 1.13 cm2 = 638.5 Ω-cm2. Aquí están las áreas de superficie generalmente aplicables a diferentes formatos de transwell/inserto: placa de 6 pocillos (inserciones de 24 mm) 4.52 cm2, placa de 12 pocillos (inserciones de 12 mm) 1.13 cm2, placa de 24 pocillos (inserciones de 6.5 mm) 0.33 cm2, placa de 96 pocillos (inserciones de 4.3 mm) 0.14 cm2. Para mediciones TEER automatizadas, considere usar el Sistema Automatizado de Medición TEER WPI REMS.

Borra cualquier dato en la memoria abriendo la configuración, el menú de almacenamiento y luego presiona nueva placa, eso borrará cualquier lectura anterior. Regresa a la pantalla principal, abre la pantalla de vista previa, selecciona cada pocillo para medir (la selección se vuelve verde), coloca el electrodo y luego mide. Cuando termines de medir los pocillos seleccionados, abre la configuración, presiona el menú de pantalla de almacenamiento y luego presiona guardar nuevo para guardar los datos de la placa en la unidad USB.

Saque el Manual EVOM™ de la campana laminar después de usarlo. La próxima vez, encienda la luz UV dentro de la campana. Una vez que la campana esté desinfectada con UV, apague la luz UV, luego rocíe etanol o isopropanol al 70-100 % sobre una toalla de papel y limpie el Manual EVOM™. No rocíe alcohol directamente sobre el Manual EVOM™.

Puedes esperar ver un cambio en los valores de resistencia en bruto. Sin embargo, debes restar los valores en blanco (Transwell en blanco sin células) de los valores de la muestra (Transwell con células). De esta manera, restas el valor en blanco con volumen aumentado de las muestras con volumen aumentado. Así, se omite cualquier cambio de resistencia causado por el aumento de volumen. Usa consistentemente los mismos volúmenes para todas tus muestras en un experimento.

Deriva: lecturas que aumentan o disminuyen continuamente de forma significativa (ya sea voltaje o resistencia) con el tiempo. Ejemplo: A 1000 Ω, la lectura aumenta 100 Ω/minuto. (Una deriva de 10 Ω/minuto es aceptable.) Una deriva excesiva puede ser causada por cambios en el pH o la temperatura, o porque el electrodo necesita limpieza.

Hay algunas cosas que pueden ser una posible causa de esta deriva.

• Asegúrese de que los electrodos estén completamente sumergidos en la solución del medio de cultivo, y que la temperatura del líquido en la placa sea constante equilibrándola a temperatura ambiente o usando un calentador de placas.
• Otra causa común de deriva es que las puntas del electrodo pueden tener depósitos de los componentes del medio de cultivo celular.
• El electrodo (las puntas) requiere limpieza enzimática (Tergazyme o Enzol) periódicamente, hasta 1 vez por semana dependiendo del uso.
• Los electrodos portátiles también deben mantenerse lo más inmóviles posible durante una medición.
• El movimiento excesivo causará fluctuaciones en la medición.
• Además, en un ambiente con 5% de CO2, la pérdida de CO2 provoca un cambio en el pH del medio, y la lectura de resistencia puede variar. Esto es principalmente aplicable en el contexto de mediciones continuas durante un período prolongado (horas, en comparación con unos pocos minutos).

Se sabe que la temperatura afecta los valores de TEER. Recomendamos mantener una temperatura constante para obtener valores consistentes. Dado que las lecturas se obtienen en medios de cultivo celular o tampones, recomendamos usar un baño de agua con temperatura fija para calentar el medio/tampon que se utilizará durante el experimento. Una temperatura constante del medio/tampon asegura una condición experimental estable. Recomendamos sacar la placa de pocillos, que contiene células cultivadas en insertos de cultivo, del incubador al menos 20 minutos antes para estabilizar la placa a temperatura ambiente antes de realizar las mediciones. 

Si está usando una cámara EndOhm, asegúrese de mantener la misma distancia fija entre los electrodos superior e inferior para obtener lecturas consistentes. Si está usando un electrodo tipo palillo (STX2), intente mantenerlo en posición vertical mientras obtiene los resultados. Mantener la misma posición al sostener los electrodos tipo palillo durante el experimento se espera que muestre lecturas consistentes.

Recomendamos usar el mismo fluido con la misma concentración iónica tanto en el lado apical (por ejemplo, la parte superior de un inserto de cultivo celular) como en el lado basolateral (por ejemplo, la parte inferior del inserto de cultivo celular dentro de un pocillo de una placa de 12 pocillos). Durante la medición, si usa tampón PBS 1X en el lado apical, recomendamos usar tampón PBS 1X en el lado basolateral. También recomendamos que ambos niveles de fluido (dentro y fuera de los insertos de cultivo celular) estén a la misma altura para minimizar diferencias de presión. Durante los experimentos, el pocillo/lado apical se llena primero con fluido para evitar que la membrana se desplace del filtro por presiones hidrostáticas.

La aplicación de volúmenes consistentes del fluido (medio/tampon) durante todos los experimentos reducirá la variabilidad de los datos.

El EVOM2 funciona bajo el principio de que una vez que se mide lo que llamamos el “pozo” (blank), esta primera medición de resistencia contiene la suma de la resistencia del electrodo, la separación del electrodo y la resistencia debida al volumen y la molaridad del medio líquido. (Cualquier diferencia de carga del electrodo se anula mediante el método de medición del EVOM2que invierte la polaridad y promedia los resultados.)

Las mediciones periódicas sucesivas del pozo son una gráfica del crecimiento de la membrana mediante una medición de resistencia, y una vez que esta gráfica de resistencia se estabiliza, podemos decir que la membrana ha alcanzado la confluencia. El EVOM2 funciona igual que un amplificador de pinza de voltaje y el sistema Ussing, pero sin la cámara especial Ussing. El

El EVOM2 sistema no es tan preciso como un Ussing, pero el propósito del EVOM2 sistema es determinar si una membrana está confluyente, no realizar un análisis detallado. (Algunos análisis de permeabilidad de membranas pueden estudiarse con el EVOM2  sistema, pero como un porcentaje de cambio en lugar de un valor absoluto de cambio.)

Varias variables experimentales influyen en los resultados de TEER, tales como:

• Temperatura,
• Condición y posicionamiento del electrodo,
• Tipo de célula y condiciones de cultivo,
• Composición del medio

Porque las células crecen y forman una monocapa compacta. Inicialmente, la TEER es baja después de la siembra, luego aumenta a medida que las células se multiplican y cubren los espacios de la membrana, formando una barrera confluyente.

La TEER se utiliza ampliamente para evaluar la función de la barrera celular y la permeabilidad en: estudios de permeabilidad y absorción de fármacos, investigación de la barrera hematoencefálica, pruebas de toxicidad y citotoxicidad, y monitoreo de tejidos y cultivos celulares.

No — TEER es no destructivo. Permite realizar mediciones repetidas a lo largo del tiempo para monitorear la integridad de la barrera sin dañar las células.

TEER alto → Barrera celular fuerte e intacta.

TEER bajo → Capa celular débil o permeable.

En algunos modelos (por ejemplo, células alveolares), puede ser necesario un tampón/medio para una medición precisa.

No. TEER es la resistencia normalizada por el área de crecimiento celular (Ω·cm²), calculada a partir de la lectura de resistencia en bruto.

NO sostenga el electrodo por el cable. Puede romper gradualmente las conexiones internas.

Sostenga el electrodo por la zona señalada con la flecha (plástico).

Limite la inmersión en líquido o el nivel de pulverización de líquido hasta aquí (máximo). No desea que el líquido entre y alcance los cables o conectores internos, por eso. Puede limpiar el resto del electrodo con una toalla de papel rociada con isopropanol o etanol (no rocíe directamente).

Si experimenta inestabilidad a 500 Ω, la lectura salta de 450 a 550 Ω y no se estabiliza (una inestabilidad de ±5 Ω es aceptable en el rango de 500 Ω). En los rangos más altos, hasta ±1000 Ω es aceptable en el rango de 100K. Los electrodos que muestran inestabilidad pueden requerir limpieza enzimática.

• Las causas más comunes de inestabilidad en la lectura pueden solucionarse sumergiendo completamente las puntas en la solución o realizando una limpieza enzimática.
• Las puntas del electrodo no están completamente sumergidas en un líquido conductor adecuado (medio o tampón). Añada líquido extra para que el nivel del líquido llegue a las puntas del electrodo. (Use volúmenes apicales y basolaterales consistentes para hacer comparaciones coherentes.) Las puntas del electrodo (región sensora) pueden tener depósitos de componentes del medio de cultivo celular, esto se puede resolver con limpieza enzimática.

Sí, tenemos dos conjuntos de EndOhms. Los EndOhms Legacy EVOM2 (ENDOHM-6G, ENDOHM-12G, ENDOHM-24G-SNAP) usan el cable 53330-01, y los EndOhms más nuevos (EVM-EL-03-01-0x), que son compatibles con el Manual EVOM™, usan el cable 99916.